酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA)是免疫檢驗(yàn)中最常用的方法之一。由于其方法上的特異性、靈敏性和操作上的簡(jiǎn)便性以及試劑的穩(wěn)定性而成為免疫檢驗(yàn)中的主要技術(shù)。盡管如此，在實(shí)驗(yàn)工作中，要使ELISA得到最準(zhǔn)確的結(jié)果，必須嚴(yán)格選擇試劑和嚴(yán)格按規(guī)程操作，并進(jìn)行全面的質(zhì)量控制。
1 試劑
1．1 試劑的選用試劑必須是國(guó)家批準(zhǔn)檢定或有生產(chǎn)批準(zhǔn)文號(hào)的試劑。使用前先測(cè)定各孔空白的吸光度值，并計(jì)算平均值，所有單個(gè)讀數(shù)與醫(yī)師招聘平均數(shù)之差應(yīng)<10％。試驗(yàn)用的蒸餾水的質(zhì)量也至關(guān)重要，不合格的蒸餾水可使空白值增高，最好使用新鮮重蒸餾水。
1．2 試劑的準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將試劑盒先從冰箱取出，在室溫下放置20 min以上后再進(jìn)行測(cè)定，使試劑盒在使用前與室溫平衡，以滿足反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度要求。
2 標(biāo)本要求
2．1 標(biāo)本應(yīng)新鮮如有細(xì)菌污染，菌體內(nèi)可能含有內(nèi)源性HRP(辣根過(guò)氧化物酶)，會(huì)發(fā)生假陽(yáng)性反應(yīng)。標(biāo)本放置過(guò)長(zhǎng)，IgG可聚合成多聚體。在間接法ELISA測(cè)定中會(huì)導(dǎo)致本底過(guò)深，造成假陽(yáng)性。此外，要避免標(biāo)本出現(xiàn)嚴(yán)重溶血。因Hb中含有血紅素基團(tuán)，其有類(lèi)似過(guò)氧化物活性，若血清中Hb濃度過(guò)高，則易于在溫育過(guò)程中吸附于固相，從而容易與后面加入的HRP底物反應(yīng)顯色，造成假陽(yáng)性。不能即刻測(cè)定的標(biāo)本，應(yīng)低溫保存，避免反復(fù)凍融。同時(shí)，標(biāo)本凝固不全，其殘留的纖維蛋白原也易造成假陽(yáng)性結(jié)果，應(yīng)待凝固完全后再分離血清。
2．2 重視預(yù)防檢驗(yàn)干擾類(lèi)風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、高濃度的非特異性免疫球蛋白、異嗜性抗體、某些自身抗體、交叉反應(yīng)物質(zhì)等在日常的臨床標(biāo)本中，非�？赡墚a(chǎn)生檢驗(yàn)干擾，造成假陽(yáng)性，也應(yīng)加以重視。
3 檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)化
加樣量要準(zhǔn)確，不可太快。液體要加在孔底，避免加在孔壁上部，此區(qū)易導(dǎo)致非特異性吸附；試劑的加入除了滴加的角度要注意以外，速度的均衡也是質(zhì)量保證之一；溫育的溫度和反應(yīng)的時(shí)間要嚴(yán)格且水浴，可使溫度迅速平衡；反應(yīng)板不應(yīng)疊加在一起，為防止蒸發(fā)最好封板；避免“邊緣效應(yīng)”，提高測(cè)定的重復(fù)性；洗板。對(duì)于ELISA來(lái)說(shuō)，這是極其關(guān)鍵的一步。其目的是反應(yīng)面中沒(méi)有與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，和在反應(yīng)中非特異吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。所用洗滌液應(yīng)按試劑盒要求顯色。顯色的時(shí)問(wèn)一定要掌握好，時(shí)間不足或過(guò)久都會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。而且需要盡量保證每批次試驗(yàn)的顯色時(shí)間一致；ELISA的比色測(cè)定用酶標(biāo)儀完成，相對(duì)可以得到可靠的結(jié)果。
4 質(zhì)量控制
包括分析前、分析中和分析后的質(zhì)量控制。同時(shí)每次試驗(yàn)都要進(jìn)行對(duì)儀器設(shè)備的維護(hù)、校準(zhǔn)以及試劑的質(zhì)檢，操作程序要標(biāo)準(zhǔn)化。同時(shí)每次測(cè)試都要有空白、陰性、陽(yáng)性對(duì)照和質(zhì)控血清�？瞻�、陰性、陽(yáng)性對(duì)照的吸光度應(yīng)在一定的范圍內(nèi)。弱陽(yáng)性的標(biāo)本應(yīng)復(fù)查或稀釋后復(fù)查，以排除前帶現(xiàn)象。每批試驗(yàn)的質(zhì)控血清必須能檢出，并記錄其s／co值，作出質(zhì)控圖，以便更深入的分析。
