三、免疫染色
可在細胞涂片或組織切片上進行免疫染色。一般程序是：①標記抗體與標本中抗原反應結合；②用PBS洗去未結合的成分；③直接觀察結果（免疫熒光直接法)；或顯色后再用顯微鏡觀察（免疫酶直接法)。在此基礎上發(fā)展出間接法，多層法，雙標記法等各種方法，將在本書各有關章 節(jié) 內詳述。
在免疫染色中應特別注意增強特異性染色，減少或消除非特異性染色。在各種免疫染色中都必須注意以下幾個問題：
1．增強特異性染色的方法
（1)蛋白酶消化法：其作用是暴露抗原，增加細胞和組織的通透性，以便抗體與抗原最大限度的結合，增強特異性染色和避免非特異性染色。這種方法已廣泛用于各種免疫細胞化學染色，常用的蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶以及鏈霉蛋白酶（pronase)等；也可用3mol/L尿素處理切片，達到酶消化的目的。各種酶的配制和使用方法詳見附錄。酶消化的時間和溫度因各種抗原對消化的敏感性不同，應根據(jù)酶的活性通過預試驗確定，消化的時間還與組織固定的時間有關，一般是陳舊固定組織所需時間長，以37。C為宜。消化時間短的組織可在室溫中進行。消化處理時間過長能損傷組織，易使切片脫落，應使用切片粘附劑，消化時間盡量縮短。
�。�2)合適的抗體稀釋度：抗體的濃度是免疫染色的關鍵，如果抗體濃度過高，抗體分子過多于抗原決定簇，可導致抗體結合減少，產(chǎn)生陰性結果。此陰性結果并不一定缺少抗原，而是由于抗體過量。這種現(xiàn)象類似于凝集反應中的前帶效應（Prozone effect )。因此，必須使用一系列稀釋作“棋盤式效價滴定”檢測抗體的合適稀釋度，以得到最大強度的特異性染色和最弱的背景染色�？贵w稀釋度應根據(jù)：①抗體效價高，溶液中特異性抗體濃度越高，工作稀釋度越高；②一般講，應用的抗體稀釋度越大，溫育時間越長。③抗體中非特異性蛋白含量、只有高稀釋度時才能防止非特異性背景染色；④稀釋用緩沖液的種類、標本的固定和處理過程等也可影響稀釋度。所以合適的稀釋度應根據(jù)自己的情況測定�？贵w的稀釋主要是指第一抗體，因為第一抗體中特異性抗體合適的嘗試是關鍵,應用高稀釋度第一抗體僅顯示主親和力的特異性染色反應,減少或消除其中交叉抗體反應。
�。�3)溫育時間：大部分抗體溫育時間為30-60min，必要時可4。C過夜（約18h)。溫育的溫度常用37。C，也可在室溫中進行，對抗原抗體反應強的以室溫為佳。37。C可增強抗原抗體反應；適用于多數(shù)抗體染色，但應注意在濕盒中進行，防止切片干燥而導致失敗。
（4)多層染色法：對弱的抗原可用間接法（雙層)、PAP和ABC法（三層)、四或五層PAP法或ABC法，或PAP和ABC聯(lián)合染色法等，可以很大程度的提高敏感性，獲得良好結果。
（5)顯色增敏劑的應用，如在過氧化物酶底物中加入氯化鎳，可提高顯色敏感度4倍。
2．減少或消除非特異性染色的方法 組織中非抗原抗體反應出現(xiàn)的陽性染色稱為非特異性背景染色，最常見的原因是蛋白吸附于高電荷的膠元和結締組織成分上。最有效方法是在用第一抗體前加制備第二抗體動物之非免疫血清（1：5-1：20)封閉組織上帶電荷基團而除去與第一抗體非特異性結合。必要時可加入2%-5%牛血清白蛋白，可進一步減少非特異性染色。作用時間為10-20min。也可用除制備第一抗體以外的其它動物血清（非免疫的)。有明顯溶血的血清不能用，以免產(chǎn)生非特異性染色。免疫熒光染色時，可用0.01%伊文氏蘭(PBS溶液)稀釋熒光抗體,對消除背景的非特異性熒光染色有很好的效果。當然使用特異性高、效價高的第一抗體是最重要的條件。洗滌用的緩沖液中加入0.85%~1%NaCl成為高鹽溶液,充分洗滌切片,能有效的減少非特異性結合而減少背景染色。醫(yī)學全在線www.med126.com
3．顯色反應的控制 免疫酶染色應注意控制：①成色質濃度和溫育時間可調節(jié) ，增加成色質的量和/或增加底物溫育時間，可增加反應產(chǎn)物強度。著色太深可減少溫育反應時間。②過氧化物酶顯色時，H2O2較大濃度將使顯色反應過快而致背景加深；過量H2O2可能抑制酶的活性。
4．復染 根據(jù)所用的染色方法和呈顯顏色等，可選用適當?shù)膹腿痉椒�。如陽性結果呈紅或棕色，則用蘇木素將細胞核染成蘭色，以便定位檢測。也可用1%～2%甲基綠復染。
四、對照
其目的在于證明和肯定陽性結果的特異性，排除非特異性疑問。主要是針對第一抗體對照，常用的對照方法包括：①陽性對照；②陰性對照；③阻斷試驗；④替代對照；⑤空白對照；⑥自身對照；⑦吸收試驗。
（一)陽性對照
用已知抗原陽性的切片與待檢標本同時進行免疫細胞化學染色，對照切片應呈陽性結果，稱為陽性對照。證明全過程均符合要求，尤其當待檢標本呈陰性結果時，陽性對照尤為重要。
�。ǘ�)陰性對照
用確證不含已知抗原的標本作對照，應呈陰性結果，稱陰性對照，是陰性對照的一種。其實空白、替代、吸收和抑制試驗都屬陰性對照。當待檢標本呈陽性結果時，陰性對照就更加重要，用以排除假陽性。對照的具體方法步驟，在有關章 節(jié) 詳述。
