一、免疫PCR
所謂免疫（Immune PCR)就是利用抗體與DNA特異結(jié)合來檢測抗原，把抗原抗體反應(yīng)與PCR聯(lián)合應(yīng)用而建立的一種抗原檢測系統(tǒng)。
在免疫PCR中，一個中介分子同時具有與DNA、抗體分子特異結(jié)合的能力。其一端連接DNA（標記物)，另一端連接抗原-抗體復(fù)合物，形成一個特殊的抗原-抗體-DNA連接物。作為標記物的DNA分子可用PCR的擴增，存在特異的PCR產(chǎn)物應(yīng)證明作為標記物的DNA分子已特異地與抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合，而且表明了抗原的存在。有人采用SAP（streptavidin – protein A)嵌合體作為中介物。它具有雙特異性結(jié)合能力，一端為鏈霉親和素，可結(jié)合生物素；另一端為可與IgG的Fc段結(jié)合的蛋白A。這樣可特異地把生物素化的DNA分子和抗原-抗體復(fù)合物連接在一起。
選用BSA作抗原進行免疫PCR實驗，結(jié)果表明，可檢測出580個抗原分子（9.6×10-22mol/L)，而且可以完全避免其它非特異信號的干擾。與采用堿性磷酸酶的ELISA相比，其靈敏度可提高105倍，較常規(guī)的放名分析靈敏度也高出幾個數(shù)量級。
免疫PCR產(chǎn)物在普通的瓊脂糖電泳上就可以檢測出來，如用更好的方法來檢測PCR產(chǎn)物，如放射性同位素，熒光物或酶等摻入到PCR產(chǎn)物中，可進一步提高其靈敏度和適用性。另外，如果采用不同大小標準的DNA進行標記，在電泳時，可同時檢測出多種不同的抗原分子。
PCR產(chǎn)物的多少與抗原結(jié)合量有關(guān)，如果用標準反應(yīng)作對照，則可以對抗原的量進行估算。因此，通過改變連接物的濃度就可以改變檢測系統(tǒng)的靈敏性。其它因素，如抗體的濃度，PCR循環(huán)周期數(shù)，PCR產(chǎn)物的檢測方法等也同樣影響系統(tǒng)的靈敏性。
二、轉(zhuǎn)錄依賴的擴增系統(tǒng)（Transcription-based Amplification System , TAS)
擴增樣本中的RNA，一般要先將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增，能否將RNA靶序列直接擴增出來呢？Kwok等人發(fā)明了TAS來解決這一問題。結(jié)合應(yīng)用葡聚糖珠寡核苷酸雜交技術(shù)可進一步提高方法的特異性和效率。其原理是：制備引物A、B，引物A與待檢RNA3’端互補，并有一T7RNA多聚酶的識別結(jié)合位點。逆轉(zhuǎn)錄酶以A為起點合成cDNA；引物B與此cDNA3’端互補，逆轉(zhuǎn)錄酶同時還具有RnaseH和DNA多聚酶的活性，又可利用引物B合成cDNA的第二鏈。RNA多聚酶以此雙鏈cDNA為模板轉(zhuǎn)錄出與待檢RN-一樣的RNA，這些RNA又進入下輪循環(huán)。RNA多聚酶從一個模板可以轉(zhuǎn)錄出10～103個拷貝，因此反應(yīng)中待檢RNA拷貝數(shù)以10的指數(shù)方式增加，較PCR高得多。擴增產(chǎn)物用葡聚糖珠夾心雜交法檢測：產(chǎn)物先與標記的探針雜交，再與包被在葡聚糖珠上的另一互補寡核苷酸（與標記探針互補的位置不同)雜交、檢測。該方法同一般雜交檢測技術(shù)相比，特異性要高出許多。
TAS主要特點是擴增效率極高，由于拷貝數(shù)是以10指數(shù)遞增，只有6個循環(huán)，靶序列即能達到2×106個拷貝。由此而來的另一個特點是特異性很高，在一般的RNa PCR擴增中，由于逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq多聚酶均無較對活性，要發(fā)生錯摻，循環(huán)次數(shù)越多，錯摻率越高。TAS僅需循環(huán)4～6次，將錯摻率降低了4/5。用葡聚糖珠夾心雜交法，又進一步提高了特異性。目前認為TAS是擴增RNA的首選方法。
三、再生式序列復(fù)制技術(shù)（3SR)
這一反應(yīng)依賴于AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RnaseH和T7RNA多聚酶的共同作用。當逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈后，RnaseH降解模板RNA，逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第二鏈，T7RNA多聚酶以此cDNA為模板，轉(zhuǎn)錄出與樣本RNA序列相同的RNA。其RNA擴增過程與TAS相同。由于所使用的工具酶工作的適宜溫度是37℃，所以只要在第一步變性、復(fù)性后，整個反應(yīng)過程不再需要溫度循環(huán)。具體方法如下：制備引物A、B，引物A有T７RNA多聚酶識別、結(jié)合位點。將引物、樣本加入擴增緩沖液中，65℃，1min，降溫至37℃，加入人工具酶，37℃保溫1h，冰浴中止反應(yīng)�？捎闷暇厶菉A心法檢測擴增產(chǎn)物。
這一方法有幾點值得注意：（1)反應(yīng)是在37℃恒溫中進行的；（2)產(chǎn)物中有RNA，反義RNA的cDNA，RNA的拷貝數(shù)高于Cdna（90：1)；（3)效率高于PCR。使拷貝數(shù)擴增到105，PCR要85min，3SR僅要15min；（4)逆轉(zhuǎn)錄酶也具有RnaseH活性，反應(yīng)又是在37℃中進行，因此推測某些病毒，如HIV-1感染的細胞內(nèi)可能存在類似3SR的病毒基因擴增機制。
四、連接酶鏈式反應(yīng)（Ligase Chain Reaction,LCR)
該技術(shù)是Landegren等人于1988年為檢出序列中點突變而設(shè)計、發(fā)明的。合成一對引物A、B，它們完成覆蓋了靶序列。經(jīng)退火與靶序列結(jié)合后，A、B間留下一個缺口（nick)，加入連接酶封閉缺品，兩引物成靶序列完整的互補鏈。如果靶序列中有點突變，引物不能與靶序列精確結(jié)合，缺口附近核苷酸的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，連接反應(yīng)不能進行，變性后引物仍是兩個。Lan－degren用生物素標記引物A，用32P標記引物B。用親和素包被的瓊脂糖珠與連接產(chǎn)物反應(yīng)，檢測其放射性。顯然，當靶序列中存在點突變時，檢測結(jié)果是陰性的。用這種方式，Landegren將人β-珠蛋白βA、βC、βS三個等位基因區(qū)別開來。Wu等人又引入PCR的原理，在連接反應(yīng)后，變性、退火、再連接，少量的靶序列就被擴增出來。Barany于1991年報道了耐熱連接酶-Taq連接酶的發(fā)現(xiàn)及其在LCR中的應(yīng)用，為LCR的實用化奠定了基礎(chǔ)。實際操作時引物為4個，A、A、 A’和B、B’，分別與靶序列的正負鏈互補。每次連接反應(yīng)的產(chǎn)物又可在下一輪反應(yīng)中當模板，靶序列以指數(shù)形式擴增出來。用上面提到的標記檢測方法，即可檢測靶序列中有無點突變。
LCR的特異性首先取決于引物與模板的特異結(jié)合，其次Taq連接酶作用的特異性，即Taq連接酶是否僅連接與靶序列完全互補的引物。實驗表明Taq連接酶的非特異活性是較低的（<1%)�？刂颇０�、酶的濃度，使反應(yīng)在接近Taq酶的溫度下進行，還可進一步降低非特異連接率。Barany用這一技術(shù)，將極少量（<200個分子)的βA、βC和βS區(qū)別開來。
LCR的擴增效率與PCR相當。由于有很高的信噪比，其敏感性也很高。用Taq連接酶做LCR只在兩個保溫點的循環(huán)（94℃、1min和65℃、4min)。產(chǎn)物檢測也非常方便、敏感。因此可以說LCR是目前檢測已知序列中有無點突變的最佳方法。
