免疫細胞化學的有關技術(shù)簡介

　　根據(jù)標記物的不同，免疫細胞化學技術(shù)可分為免疫熒光細胞化學技術(shù)，免疫酶細胞化學技術(shù)，免疫鐵蛋白技術(shù)，免疫金-銀細胞化學技術(shù)，親和免疫細胞化學技術(shù)，免疫電子顯微鏡技術(shù)等。近些年來，核酸分子原位雜交技術(shù)采用生物素、地高辛等非放射性物質(zhì)標記探針，和免疫細胞化學技術(shù)密切結(jié)合，發(fā)展為雜交免疫細胞化學技術(shù)。不同的免疫細胞化學技術(shù)，各具有獨特的試劑和方法，但其基本技術(shù)方法是相似的，都包括抗休的制備，組織材料的處理、免疫染色、對照試驗、顯微鏡觀察等步驟。還有雙重和多重標記技術(shù)也有重要的用途。

　　一、抗體的制備和配制

　�。ㄒ�)抗體的制備

　　這是免疫細胞化學技術(shù)的首要試劑，必需制備具有很高特異性和敏感性的高效價抗體，這將在本書第二章　中詳述。目前國內(nèi)外市場各種特異性抗體日益增多，許多實驗室直接應用市售產(chǎn)品，現(xiàn)在我國自制抗體種類少，發(fā)展抗體生產(chǎn)十分必要。尤其要定位一種新的抗原物質(zhì)，能夠自制較好。

　�。ǘ�)抗體的配制

　　包括抗體貯存液和抗體使用液的配制方法。新制備或購進的是原液或凍干品，抗血清為全血清，單克隆抗體是培養(yǎng)上清液或腹水。

　　1．抗體貯存　　獲得新抗體后，應先根據(jù)生產(chǎn)廠家提供的抗體效價，將其分裝，可每10μl或100μl/支分裝入安瓿或0.25ml帶蓋塑料管中，密封。放入-20。C~40。C冰箱中保存?zhèn)溆�，一般可保�?~2年。小量分裝的抗體可1次用完，避免反復凍融而影響效價的降低。一般用前新鮮配制使用液體，稀釋的抗體不能長時間保存，在4。C可存入1~3天，超過7天效價顯著降低。

　　2．抗體使用液的配制　　這是任何免疫細胞化學方法中最重要的一環(huán)，無論是一抗、二抗和各種標記抗體，用前都必須按不同免疫染色方法和抗原性強弱與抗原的多少，稀釋使用的各種抗體原液，以便獲得最佳免疫染色結(jié)果。

　�。�1)抗體最佳稀釋度的測定方法：用已知陽性抗原切片，進行免疫染色，將其陽性強度與背景染色強度以“+”表示，可分為++++、+++、++、+、（-)。++++為最強陽性，+++為強陽性，++為較強陽性，+為弱陽性，（-)為陰性。

　�、僦苯訙y定法：用于測定第一抗體的最佳稀釋度，其它條件穩(wěn)定可靠。將一抗稀釋為1：50、1：100、1：2001：400、1：500等5個稀釋度滴加在陽性抗原切片上，同時設一替代和陰性對照，結(jié)果如表1-1：

表 1-1 選擇最佳稀釋抗血清方法

　　從表中結(jié)果可見，第一抗體稀釋到1：400時陽性結(jié)果呈強陽性，背景染色減少，其最佳稀釋度在1：400~500之間。再作1：420、1：440、1：460、1：480、1：500稀釋后染色，找出最佳稀釋度。

　�、谄灞P（方陣)測定方法：當測定兩種以上抗體的最佳配合稀釋度時，必須采用此法（見表1-2)。

表1-2 兩種以上抗體最佳配合稀釋度選擇表

　　括號內(nèi)為背景染色結(jié)果

　　從表中可見第一抗體1：1000，第二抗體1：2000接近最佳稀釋度，再將一 抗體作1：600、1：700、1：800、1：900和1：1000稀釋，即可找出最佳稀釋度。醫(yī)學全在線www.med126.com

　�。�2)抗體稀釋液的配制：常用0.01mol/l pH7.4PBS或TBS緩沖液作抗體稀釋液�？捎靡韵路椒ㄅ渲茖Ｓ玫目贵w稀釋液，防止抗體效價下降，減少抗體在組織上的非特異性吸附：取0.05mol/l pH7.4 TBS100ml，加溫到60。C，再加入優(yōu)質(zhì)明膠100mg，攪拌溶解后，冷卻至室溫，加入1g牛血清白蛋白，加入NaN3200mg溶解后，過濾，分裝，4。C保存。

　　抗體的最佳稀釋度由于各種抗體的效價不同，組織中抗原強弱不一，應根據(jù)不同情況作適當?shù)恼{(diào)整，以取得中等陽性稀釋度為佳，因其既適合于抗原性強和含量多的標本，也可用于抗原性弱的標本。

　　二、組織材料的處理

　　組織材料的處理是獲得良好免疫組織化學結(jié)果的前提，必需保證要檢測的細胞或組織取材新鮮，固定及時，形態(tài)保存完好，抗原物質(zhì)的抗原性不丟失、不擴散和被破壞（下節(jié)　詳述)。

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