研究蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)從確定組成蛋白質(zhì)的單元結(jié)構(gòu)棗氨基酸算起，已有150年的悠久歷史，直到1955年，Sanger首次闡明胰島素的氨基酸排列順序，為研究蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)開辟了道路。這在分子生物學(xué)的發(fā)展進(jìn)程中是一個重要突破。目前關(guān)于核酸的一級結(jié)構(gòu)研究，由于Sanger等發(fā)明了加減法，可以得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。對此之下，關(guān)于蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展不如核酸迅速。但隨著Edman液相自動順序分析儀和固相順序分析儀以及氣相色譜質(zhì)譜(GCMS)等方法的相繼出現(xiàn)。使結(jié)構(gòu)分析的速度也顯著加快。至今已完成近千種蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)分析。目前不僅樣品用量減少，而且工作人員也大大減少。當(dāng)年Sanger分析胰島素用了整整十年的時間，今天運用自動化儀器，分析一個分子量在10萬左右的蛋白質(zhì)只需要幾天，可見新技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展對科學(xué)發(fā)展起的促進(jìn)作用，蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定方法的綜述及專著文獻(xiàn)較多，這里只扼要加以概述。
蛋白質(zhì)分子的一級結(jié)構(gòu)測定，概括起來包含多肽鏈的分離、降解、肽段的分離和順序分析以及－S－S－定位等。
一級結(jié)構(gòu)的測定方法可概述如下：
1.多肽鏈的分離
在測定一個蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)以前，首先必須保證被測蛋白質(zhì)的純度，使結(jié)果準(zhǔn)確可靠。其次要了解它的分子量和亞基數(shù)，按照其亞基數(shù)將蛋白質(zhì)分成幾個多肽鏈。
1)肽鏈的拆開
蛋白質(zhì)分子多肽鏈的連接有共價結(jié)合和非共價結(jié)合兩種。要拆開以共價結(jié)合的-S-S-連接的多肽鏈，必須采用的化學(xué)處理方法常有：
①過甲酸氧化
用氧化劑過甲酸斷裂-S-S-。這個反應(yīng)一般在0℃下進(jìn)行2小時左右，兩個S就全部能轉(zhuǎn)變成磺酸基，這樣被氧化的半胱氨酸稱為磺基丙氨酸。
如果蛋白質(zhì)分子中同時存在半胱胺酸，那么也會被氧化成磺基丙氨酸。此外甲硫氨酸和色氨酸也可被氧化，從而增加分析的復(fù)雜性。
�、趲�基乙醇還原
利用還原劑巰基乙醇亦可使蛋白質(zhì)的-S-S-斷裂。當(dāng)高濃度的巰基乙醇在pH8?條件下室溫保溫幾小時后，可以使-S-S-定量還原為桽H。與此同時反應(yīng)系統(tǒng)中還需要有8摩爾脲或6摩爾鹽酸胍使蛋白質(zhì)變性，多肽鏈松散成為無規(guī)則的構(gòu)型，此時還原劑就可作用于-S-S-。此反應(yīng)是可逆的，因此要使反應(yīng)完全，疏基乙醇的濃度必需在0.1-0.5摩爾。
③Cleland試劑的還原作用
Cleland′s指出二硫赤蘇糖醇(dithioerythriotol)及二硫蘇糖醇(dithiothriotol)在氧化還原能力上是比較強的試劑，只要0.01摩爾就能使蛋白質(zhì)的-S-S-還原，反應(yīng)基本與疏基乙醇相似，且在許多球蛋白反應(yīng)中，可以不用變性劑。
Cleland試劑首先與蛋白質(zhì)-S-S-形成中間物，反應(yīng)終了，還原劑被氧化形成一個穩(wěn)定的六環(huán)化合物，蛋白質(zhì)則被還原。
還原蛋白不穩(wěn)定，SH基極易氧化重新生成-S-S-鍵。穩(wěn)定SH基的方法有：
(A)烷基化試劑使SH基轉(zhuǎn)變?yōu)榉�(wěn)定的硫醚衍生物。
如果碘代乙酰胺代替碘代乙酸，其產(chǎn)物S羧氨甲基衍生物不帶電荷，磺代乙酸也可與組氨酸、蛋氨酸和賴氨酸發(fā)生反應(yīng)，但反應(yīng)條件不同，可通過各種pH及反應(yīng)時間進(jìn)行控制。
(B)氨乙基化
蛋白質(zhì)分子的幾條肽鏈若以非共價健結(jié)合，則用尿素、鹽酸胍等變性劑即可拆開。蛋白質(zhì)的多肽鏈被拆開后，將它分離純化，一般多用凝膠過濾、離子交換、電泳等方法，茲不贅述。
分離純化后的每條肽鏈還要進(jìn)一步分析其末端。
