全球60 億人口中, 約1/2 人口生活在乙肝病毒(HBV ) 高流行區(qū), 約20 億人證明有HBV 感染, 3～4 億人為HBV 慢性感染, 每年約有100 萬人死于HBV 感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)。2005 年12 月10 日中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會和中華醫(yī)學(xué)會感染學(xué)分會, 中國肝炎防治基金會聯(lián)合發(fā)布我國首部《慢性乙型肝炎防治指南》, 作為診治乙肝規(guī)范性的行動指南。目前國內(nèi)檢測HBV感染血清學(xué)標(biāo)志物應(yīng)用較多的仍是ELISA 方法。其有以下缺點(diǎn): 無法定量、靈敏度低, 由檢測原理帶來的前帶現(xiàn)象無法解決, 易污染, 無法完成HBV 感染的動態(tài)觀察以及低水平HBV 感染指標(biāo)檢測; 免疫膠體金檢測技術(shù)可大大縮短檢測時間, 不需要特殊設(shè)備, 操作簡單, 但靈敏度欠佳, 假陽性問題難以克服。
隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展, 先進(jìn)診斷技術(shù)不斷出現(xiàn), 時間分辨熒光免疫分析技術(shù)(TRF IA ) 是近年發(fā)展起來的無環(huán)境污染的高靈敏度免疫標(biāo)記檢測技術(shù)。乙肝作為常見病毒感染性疾病之一, 臨床上常用ELISA 法定性檢測乙肝病毒血清學(xué)標(biāo)志物作為診斷HBV 是否感染的依據(jù), 由于鉤狀效應(yīng)和敏感性的原因, 常造成HBV 感染的漏診。臨床實(shí)踐表明, TRF IA 法定量檢測乙肝病毒五項血清標(biāo)志物對乙肝診治的臨床應(yīng)用越來越顯示出其優(yōu)越性。
1.材料和方法
1.1 標(biāo)本來源 收集2004年6 月～2005年9月在我院門診和病房就診患者血清標(biāo)本920份,并分別定量和定性檢測HBV 血清免疫學(xué)標(biāo)志的全部結(jié)果。所有患者均采集靜脈血,于當(dāng)日分離血清, -70℃保存, 并于1 w 內(nèi)檢測。
1.2 試劑 上海新波生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的HBsAg, 抗-HBs, HBeAg, 抗-HBe 和抗-HBc 定量檢測試劑盒, 批號為20050720; 北京萬泰有限公司生產(chǎn)的ELISA 法定性試劑盒, 批號為B20050101;衛(wèi)生部臨檢中心提供的乙肝病毒血清學(xué)標(biāo)志物質(zhì)控品, 批號20050521。
1.3 儀器 Anytest2000 型時間分辨熒光免疫分析儀,DYNEX-MRX 型酶標(biāo)儀。
1.4 方法 乙肝病毒血清學(xué)標(biāo)志物定量的TRF IA 法和定性的ELISA 法檢測, 均嚴(yán)格按照試劑盒各自說明書和《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》中的要求, 兩種方法同時分別對不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測。
1.5 結(jié)果判定 ELISA 法定性結(jié)果參照試劑說明書中的判定方法, 經(jīng)過本室嚴(yán)格檢測, TRF IA 法檢測的不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)ELISA 法定性檢測的結(jié)果為: 以HBsAg≥1.0 ng/ml, 抗-HB s≥10 mIU/ml, HBeAg ≥0.5 NCU/ml, 抗-HBe≥4.0 NCU/ml, 抗-HBc≥0.6 NCU/ml 判定為陽性, 反之為陰性, 見表1。
1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 用Excel管理數(shù)據(jù)庫和SPSS11.0 軟件統(tǒng)計分析, 方法學(xué)間數(shù)據(jù)比較用χ2檢驗(yàn)。
2.結(jié)果
2.1 分別用TRF IA 法和ELISA 法對920 份臨床血清標(biāo)本進(jìn)行檢測, 參照表1 中判定乙肝病毒五項血清學(xué)標(biāo)志物定量的陰陽性的方法,所有標(biāo)本均經(jīng)AXSYM免疫分析儀微粒子酶免分析法檢測HBV感染血清學(xué)標(biāo)志物驗(yàn)證(此驗(yàn)證方法目前是公認(rèn)的診斷HBV 感染的血清學(xué)方法) , 結(jié)果對比如表2。
2.2 TRF IA法的敏感性: 對0.2 ng/ml HBsAg,10 mIU/ml 抗-HBs, 0. 05 NCU/ml HBeAg, 2 NCU/ml 抗-HBe和0.2 NCU/ml 抗-HBc標(biāo)準(zhǔn)樣品TRF IA法均可檢出, 而ELISA法除抗-HBs為±外, 其余均未檢出。
3.討論
傳統(tǒng)的ELISA 方法對乙肝兩對半血清標(biāo)志物定性測定, 只能判斷其陰陽性, 無法得知其真正的濃度, 給臨床診斷和治療帶來許多不便。而HBV 血清標(biāo)志物定量檢測能較為準(zhǔn)確地反映其血清中的含量, 可以間接反映體內(nèi)HBV 復(fù)制活躍程度, 對臨床藥物療效評價具有重要意義。兩對半定量檢測結(jié)果的有效性在檢測的過程中直接進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)量化質(zhì)控, 分高中低及三個定值質(zhì)控品; 兩對半定性檢測的室內(nèi)質(zhì)控, ELISA 只能間接進(jìn)行質(zhì)控, 分陰陽性質(zhì)控品, 免疫膠體金檢測則不能進(jìn)行嚴(yán)格的室內(nèi)質(zhì)控, 從而來保證檢測結(jié)果的有效性和溯源性。
在急性乙肝早期能及早檢出HBsAg, 確證HBV感染, 縮短窗口期; 其次
, 可發(fā)現(xiàn)低濃度HBsAg攜帶者; 在部分慢性乙肝患者中, 由于機(jī)體缺乏對HBV 包膜蛋白的免疫應(yīng)答, HBsAg 表達(dá)較低, 酶標(biāo)檢測可出現(xiàn)HBsAg和抗-HBs 均陰性的情況, 定量檢測則可避免這些情況的發(fā)生, 為正確判斷病情提供依據(jù)。定量分析HBsAg 和抗-HBs 的濃度變化, 可預(yù)見急性乙肝是否處于恢復(fù)期。如HBsAg 濃度降低, 抗-HBs 濃度逐漸升高, 可說明病情正往恢復(fù)期發(fā)展; 反之,HBsAg 濃度處于較高水平或上升趨勢, 而抗-HBs一直處于較低水平, 則易發(fā)展為慢性乙肝或病毒攜帶者。定量分析HBsAg和抗-HBe的濃度變化, 可反映病情變化和治療效果。定量檢測能明確HBsAg 向抗-HBe 轉(zhuǎn)換的時期, 即表現(xiàn)為HBsAg 濃度下降和抗-HBe 升高的過程。高濃度的HBsAg 還可間接提示病毒處于高復(fù)制狀態(tài), 具有較高的傳染性; 高濃度的抗-HBe 一方面提示病情好轉(zhuǎn), 而在某些時候(如肝功能指標(biāo)很差) 則可能與zxtf.net.cn肝壞死、肝硬化、肝癌有關(guān); 抗-HBc 濃度的高低可反映病毒感染的狀態(tài); 高濃度的抗-HBc提示乙肝急性感染, 恢復(fù)期濃度降低; 慢性乙肝呈抗-HBc持續(xù)高濃度; 而低濃度的抗-HBc 一般為恢復(fù)期或既往感染。對920份臨床血清檢測結(jié)果進(jìn)行比較, TRF IA 法檢測乙肝病毒五項血清學(xué)標(biāo)志物的靈敏度均高于ELISA 法, 并具有較好的重復(fù)性, 檢測結(jié)果顯示, 兩種方法HBeA g, 抗-HBs 結(jié)果一致率較好, 其余3 個指標(biāo), TRF IA 法檢測陽性率均大于ELISA 法, 具有顯著性差異(見表2)。TRF IA 法檢測較ELISA 法檢測更敏感, 可減少低濃度HBsAg 感染病人的漏診, 以及隱匿性慢性乙型肝炎的漏診。TRF IA 檢測HBsAg 靈敏度可達(dá)012 ng/ml, 而ELASA 檢測的靈敏度是2 ng/ml, 極大地提高了檢測的靈敏度。
血中HBV-DNA 的存在是HBV 感染最為直接、靈敏和特異的指標(biāo), 但我們不能因此而斷言病毒基因檢測可取代HBV 血清標(biāo)志物定量檢測,基因檢測所顯示的優(yōu)越性也恰恰是它的缺陷之所在,我們只能通過它來判斷病原體的有無和量的多少,至于病原體進(jìn)入體內(nèi)之后的反應(yīng)(即感染后的免疫應(yīng)答) , 是判斷被感染者病情、治療反應(yīng)、預(yù)后、以及流行病學(xué)調(diào)查的重要依據(jù)�？陀^地講, 基因檢測和免疫學(xué)定量檢測在目前應(yīng)當(dāng)互補(bǔ)共存, 絕大多數(shù)情況下兩者缺一不可。因?yàn)橐腋蜨BsAg 是乙肝病毒的外殼物質(zhì), 本身沒有傳染性, 它的陽性往往提示有完整的病毒顆粒存在, 國外報道HBsAg 陽性患者檢測HBV-DNA 陽性率52%, 但HBsAg 單陽性中, HBV-DNA 全為陰性, 這說明血清標(biāo)志物僅有HBsAg 陽性的患者體內(nèi)病毒數(shù)量比較少, 復(fù)制水平也很低不具傳染性, 但也有報道稱, HBsAg的滴度與HBV-DNA 定量檢測結(jié)果明顯呈正相關(guān)。陽性組HBV-DNA 全陰性, 可能是因?yàn)镠BsAg 滴度低, 當(dāng)?shù)味壬邥r, 常伴有HBeAg, 抗-HBe, 抗-HBc等血清標(biāo)志物的出現(xiàn)。HBeAg 產(chǎn)生于病毒內(nèi)部, 與Dane 顆粒呈正相關(guān), 可分泌至血液中, e 抗原陽性是HBV 復(fù)制活躍的血清學(xué)指標(biāo), 血清HBeAg 陽性說明傳染性強(qiáng), 國外報道HBeAg 陽性HBV-DNA陽性率為94%～100%, 當(dāng)血清HBeAg 轉(zhuǎn)陰后, 可出現(xiàn)抗-HBe, 抗-HBe 陽性說明病毒復(fù)制減少, 傳染性弱, 但并非沒有傳染性。小三陽HBV-DNA 陽性率低于大三陽, 但仍高于HBsAg 單陽性組, 抗-HBc-IgG 與Dane 顆粒無關(guān),提示為既往感染, 無傳染性。單純性的抗-HBc-IgG陽性時的HBV-DNA 陽性率多數(shù)報道認(rèn)為在1% 以下。但是抗-HBc 是HBV 感染后血清中最早出現(xiàn)HBV 標(biāo)志性抗體, 在HBV 感染的“窗口期”, 抗-HBc 往往是唯一可檢測出的HBV 血清標(biāo)志物,ELISA 定性檢測的敏感性、特異性、陽性檢出率都不如TRF IA 法定量檢測。另外乙肝患者恢復(fù)期和機(jī)體開始產(chǎn)生免疫力時, 血清中可有多種抗體陽性, 抗-HBs, 抗-HBe, 抗-HBc 三抗體之間可出現(xiàn)多種組合, HBsAg 陰性并不能排除HBV 感染, 有的血清仍有一定的傳染性。雖然對HBsAg 陰性持有不同的解釋, 如: ①HBsAg 含量太少, 現(xiàn)在檢測技術(shù)無法檢出; ②HBV 感染而HBsAg 陰性可為乙肝的一個亞型; ③HBsAg
與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)網(wǎng)抗-HBs 結(jié)合成復(fù)合物,使其在血中難以檢測出等諸多影響因素。但是乙肝血清學(xué)標(biāo)志物定量是利用時間分辨熒光定量的方法進(jìn)行的, 大大地提高了檢測水平。
總之, 同人們從接受腫瘤標(biāo)志物定性到定量的過渡一樣, 隨著現(xiàn)代乙肝臨床診治的需要, 乙肝血清學(xué)標(biāo)志物定量檢測的臨床應(yīng)用價值將顯現(xiàn)出來。
