（4)雜交后漂洗
①在每管中加入1.25ml 50%甲酰胺-2×SSC（pH7.0)，在42℃靜置10～15min。偶爾旋轉(zhuǎn)以助混勻。冷卻至室溫。加100μl經(jīng)dimethylsuberimidate(DEMS)處理的血細(xì)胞（107/ml)混勻，離心，室溫，10min，輕彈試管使沉淀的小塊散開(kāi)，加入1.25ml 2×SSC(pH7.0)，42℃，繼之，靜置于室溫10～15min，如前離心，再加1.25ml IBM-Triton X-100,室溫靜置5min，離心。
注：DEMS處理紅細(xì)胞方法：經(jīng)漂洗并離心去除白細(xì)胞和血清的紅細(xì)胞在鹽液如PBS中，細(xì)胞含量為108/ml，以K2CO3和DEMS溶液處理3次，第1次：K2CO3為20mmol/L,DEMS為3mmol/L，以后2次：K2CO3依然為20mmol/L，而DEMS為10mmol/L。在應(yīng)用前將K2CO3和DEMS液混合加入紅細(xì)胞混懸液中。在最后2次漂洗液中，應(yīng)用100mmol/l K2CO3將pH調(diào)至9～10。在25℃，15min后，加入50μl，100mmol/l 的檸檬酸（citric acid)/每ml細(xì)胞混懸液的濃度以達(dá)固定紅細(xì)胞的目的。固定的紅細(xì)胞離心傾去上清液后，用2×SSC稀釋到108/ml，加0.1%疊氮鈉可在4℃保存至少1年。
（5)AFF標(biāo)記的熒光顯示：加200μl的PBS含0.05%Tween和2%正常血清（NGS)，輕輕振蕩混勻，室溫靜置10min，加20μl 1：100的單克隆抗AFF抗體，37℃孵育45min，加1.25ml的PBS-Tween，室溫靜置10min，加20間歇性振蕩，離心，傾去上清液，加200μlPBS含0.05%Tween –2%NGS,振蕩，室溫靜置10min，加20μl的羊抗小鼠–FITC熒光標(biāo)記抗血清，稀釋度1：100～1：300。孵育于37℃45min，加1.25ml PBS –Tween,室溫靜置10min，離心，傾去上清液。
（6)生物素標(biāo)記探針的熒光顯示：加200μl 4×SSC含0.1%Trion X-100 和5%BSA。室溫靜置10min后，加20μl抗生物素標(biāo)記FITC抗血清15μg/ml，孵育在37℃30min，以1.5ml 4×SSc –0.1% Trion X-100洗1次，加入1.25ml IBm –Triton X-100,室溫靜置10～15min，間歇振蕩、離心。
�。�7)熒光顯微鏡觀察：將細(xì)胞核混懸液稀釋于250μl的IBM-Trion X-100中，輕加振蕩混勻。為抗熒光褪色可加等量的抗褪色溶液至載片上的細(xì)胞核涂片上，選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長(zhǎng)觀察。
�。�8)流式細(xì)胞計(jì)：將750μl的細(xì)胞核混懸液通過(guò)流式細(xì)胞儀（Flow cytometry, FCM)，DEMS處理過(guò)的紅細(xì)胞作為對(duì)照（Df 530/30nm, Omega ·Optical Inc, Brattleboro, VT)。詳細(xì)操作見(jiàn)第十章 。
二、寡核苷酸探針的應(yīng)用
寡核苷酸探針的優(yōu)點(diǎn)在于它能根據(jù)需要人工用DNA合成儀合成，其長(zhǎng)度及分子大小比較一致，可以控制。其長(zhǎng)度一般較克隆的DNA片段短。目前，寡核苷酸探針已能成功的為放射性同位素、熒光素、生物素和地高辛所標(biāo)記，并成功地運(yùn)用于培養(yǎng)細(xì)胞、組織切片和染色體鋪片等的原位雜交中。雖然有些科技工作者認(rèn)為其敏感度不如來(lái)自質(zhì)粒擴(kuò)增的cRNA或DNA探針，但由于探針制備簡(jiǎn)便再加之于近年非放射性標(biāo)記的成功，寡核苷酸探針在生物基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)及臨床學(xué)科領(lǐng)域中得到較為廣泛的應(yīng)用。
在原位雜交組織化學(xué)中應(yīng)用寡核苷酸探針，其基本操作要點(diǎn)是相同的，如雜交溫度在Tm -25℃，雜交孵育時(shí)間以過(guò)夜（16h左右)為佳。應(yīng)用寡核苷酸探針在原位雜交組織化學(xué)技術(shù)中的成功與否主要決定于探針的設(shè)計(jì)，使有效配對(duì)率增加而錯(cuò)配（mismatch)減少。
�。ㄒ�)地高辛標(biāo)記寡核苷酸探針的應(yīng)用
1．組織處理
�。�1)冷凍切片：厚10～20μm，貼于事先經(jīng)清潔處理及涂有粘附劑的切片上。切片保存于-80℃，在應(yīng)用于雜交實(shí)驗(yàn)前，使迅速回升到室溫，干燥，固定于3%多聚甲醛-PBS溶液中，pH7.4。PBS漂洗5min×3，孵育在2×SSc 10min。醫(yī).學(xué) 全在.線(xiàn),提供www.med126.com
（2)石蠟包埋切片：浸入二甲苯10min移除石蠟，以100%乙醇10min ×2，空氣干燥10min，從高到低梯度乙醇（95%，80%，70%)1min/每個(gè)濃度。PBs 5min×3，孵育在2×SSc 10min。
�。�3)離心細(xì)胞涂片：將細(xì)胞先以4%多聚甲醛固定，應(yīng)用離心沉淀法，將沉淀物涂于有粘附劑的載片上，應(yīng)用PBS（含5mmol/l MgCl2)5min×3漂洗。在0.1mol/L三乙醇胺含0.25%(V/V)乙酸酐10min。在0.2mol/l Tris –HCl 含（0.1mol/L甘氨酸)pH7.410min。孵育在2×SSc 10min。
2．探針準(zhǔn)備35pmol的寡核苷酸（oligo -)探針，3’ 終末標(biāo)記以地高辛-11–dUTP。
3．預(yù)雜交和雜交加約300μl預(yù)雜交液（配制法見(jiàn)附錄)在每張載片上，室溫孵育1h。如為鯡魚(yú)精子DNA，在應(yīng)用前須在沸水浴中加熱10min，而對(duì)酵母tRNA可不用加熱變性。
�。�1)應(yīng)用預(yù)雜交液稀釋地高辛標(biāo)記的Oligo-探針，探針理想工作濃度根據(jù)于待測(cè)核苷酸含量和實(shí)踐的結(jié)果。如對(duì)于檢測(cè)大鼠垂體的前促黑激素（proopiomelanocortin,POMC)mRNA的Oligo –探針，其理想工作濃度為342ng/ml(0.342ng/μl)。
�。�2)預(yù)雜交后以2×SSC漂洗，以吸水紙拭干切片周?chē)�，�?0μl雜交液在切片上，加硅化蓋玻片，在37℃過(guò)夜。如探針大于36堿基則雜交溫度為42℃。次日室溫2×SSC液漂洗切片1h，1×SSC漂洗切片1h（室溫)，0.5×SSc 37℃漂洗半小時(shí)，0.5×SSC室溫漂洗半小時(shí)。
4．地高辛顯示（同前)。
�。ǘ�)同位素標(biāo)記寡核苷酸探針的應(yīng)用
1．組織處理大鼠應(yīng)用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，經(jīng)心臟灌注4%多聚甲醛-磷酸緩沖液中，約2h后（也可置于4℃冰箱過(guò)夜)取腦浸于同樣固定液中加10%蔗糖溶液過(guò)夜，4℃。次日恒冷箱切片（-14℃)，厚14μm左右，貼于有粘附劑的載片上，37℃或室溫干燥以增加切片的粘附性。
2．雜交前處理同本章 第二節(jié) 放射性標(biāo)記cRNA探針一節(jié) 。
3．雜交37℃過(guò)夜，余細(xì)胞同前。
4．雜交后漂洗2×SSc 5min×3，1×SSc 1min室溫，0.5×SSc 55℃15min×2，室溫漂洗于0.5×SSc 3min×2。梯度酒精脫水，切片室溫干燥。
5．浸核乳膠切片浸入核乳膠，黑盒封閉，在4℃曝光2～3周（視同位素種類(lèi))，顯影，復(fù)染，觀察。
�。ǖ诙�、三節(jié) 中所用試劑配制見(jiàn)附錄)。
