臨床生物化學(xué):第三節(jié)　分子生物學(xué)實驗診斷技術(shù)

一、核酸雜交技術(shù)

檢驗方法建立的基本要素是特異性和靈敏度，在復(fù)雜的物體中，使無法感覺的特定物質(zhì)進入人類的觀察范圍。核酸雜交檢測技術(shù)就是利用核酸堿基嚴格配對的特異性，核酸標記物的靈敏度而建立的檢測核酸結(jié)構(gòu)與功能的方法。該法建立以來已有二十年，目前研究實驗室用得多，臨床實驗室用得較少，除成本高外，關(guān)鍵是操作復(fù)雜，重復(fù)性差，僅能半定量。成本高可隨經(jīng)濟發(fā)展而緩和，但其它缺點尚需努力克服。

雜交實驗的探針應(yīng)具有特異性，對應(yīng)不同的雜交方法靶基因（被檢基因)應(yīng)有一定的純度與豐度。雜交反應(yīng)的開始是碰撞，探針濃度高則速率增加，一般³²P標記探記探針5-100ng/ml，非放射性探針25-1000ng/ml，原位雜交無論放射還是非放射物標記，一般都需0.1-5.0μg/ml。當(dāng)探針過量時，雜交速率取決于探針長度，如一個100ng/ml20個核苷酸的合成寡核苷酸探針與1-100pg 1kb長的靶基因雜交，10分鐘能達到最大雜交率。而相同條件下2kb的克隆探針需160小時。主要原因是這里所指濃度是重量濃度而非摩爾濃度。長探針因標記量大，小的摩爾濃度已足以達到需要的檢測靈敏度。為了促進長探針（＞250個核苷酸)的雜交速率，加入雜交促進劑是非常必要的。最常用的是硫酸葡聚糖，使用濃度為5％-10％，濃度過高會增加雜交液粘度。聚乙二醇也作為促進劑，價廉且粘度低，但檢測本底太高。另外雜交的溫度、鹽濃度、甲酰胺濃度可調(diào)節(jié)雜交分子形成的穩(wěn)定性。理論選用DNA：DNA雜交溫度T＝Tm－25℃，此時雜交分子最易形成。但具體實驗中影響Tm值的因素很多，一般雜交溫度低，形成的雜交分子較穩(wěn)定。RNA：DNA雜交分子的Tm大10-15℃，RNA：RNA雜交分子的Tm大20-25℃，使得雜交溫度提高，此時需調(diào)節(jié)甲酰胺濃度來調(diào)節(jié)雜交溫度。好的實驗條件最終應(yīng)在實踐中摸索建立。

（一)斑點雜交

將少量核酸樣品點樣在硝酸纖維素濾膜上，80℃烘烤后可牢固地固定在膜上，再用探針進行雜交。尼龍膜，特別是聚偏氟乙烯膜（PVDF)與DNA結(jié)合力更高，堅韌、易操作。點樣可手工，也可用真空點樣品。檢測可用放射性探針自顯影或非放射性探針顯色�？捎糜贒NA或RNA分析。下面以非放射性探針分析DNA為例，結(jié)果是顯色。

取硝酸纖維素膜和濾紙在2xSSC(NaCl 300mmol/L，檸檬酸鈉30mmol/L)，pH7.0浸15分鐘，平鋪濾紙在點樣抽濾器上，再鋪上硝酸纖維濾膜，真空抽氣使點樣器減壓，膜顯出凹面。點樣50μl（5-10μgDNA，可直接點血清樣品)于凹面，撤去真空，把膜晾干。取濾紙浸0.5mol/l NaOH，1.0mol/l NaCl，把膜平鋪于濾紙上20分鐘，變性。取濾紙二張分別浸在0.5mol/l Tris-Hcl pH7.5和1.0mol/l Tris-HCl，0.6mol/l NaCl pH7.5，分別依次把膜平鋪于濾紙上，各中和15分鐘，中和后膜的pH為7.2-7.5。于80℃，30-45分鐘烘干。（RNA分析點樣緩沖液系統(tǒng)不同，無需變性，中和，余大致相同)用塑料封口機把膜和2.5ml預(yù)雜交緩沖液封入塑料袋中，42℃，水浴30分鐘。

50xDenhardt：5g聚蔗糖（Ficoll，400型，Parmacia)，5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白（組份Ⅴ，Sigma)加水至500ml。過濾后－20℃保存。

探針2ml（50-100ng/2ml預(yù)雜交緩沖液)于100℃，10分鐘，馬上置冰浴5分鐘（變性)。加入袋封口。42℃水浴過夜。去雜交液（可回收)。以2xSSC，0.1％SDS15ml，50℃5分鐘洗二次。0.1SSC，0.1％SDS洗二次。封閉：另取袋封入膜和封閉液（蛋白質(zhì)50mg/ml，100mmol/l Tris-HCl(pH7.5)/150mmol/LNaCl)2.5ml，37℃，30分鐘。去封閉液（可回收)。100mmol/lTris-HCl(pH7.5)/150mmol/L NaCl ，15ml，5分鐘洗二次。親和反應(yīng)：酶標抗體3ml（酶有堿性磷酸酶、過氧化物酶等，標記物有抗地高辛、生物素等，現(xiàn)以地高辛標堿性磷酸酶為例4μg/3ml 100mmol/L Tris-HCl，150mmol/l MgCl₂，10mg/ml牛血清白蛋白)，封入袋中37℃，30分鐘。100mmol/l Tris-Hcl，100mmol/l NaCl，50mmol/l MgCl₂，pH9.5，10ml，1分鐘洗一次。取硝基四氮唑蘭（NBT)75mg/ml 70％二甲基甲酰胺25μl，4-溴-5-氯-3-吲哚磷酸50mg/ml二甲基甲酰胺20μl（底物)和100mmol/l Tris-HCl，100mmol/l NaCl，50mmol/l MgCl₂，pH9.56ml混勻，37℃，避光反應(yīng)三小時，顯色。蒸餾水洗膜，晾干。觀察結(jié)果。

（二)Southern blot

1975年E.Southern發(fā)明了將DNA切開，電泳分離，再變性，印跡到硝酸纖維（Nc)濾膜上，用探針進行雜交，檢測DNA的方法。自顯影或顯色用于DNA分析。以³²P標記放射性探針為例，放射自顯影觀察結(jié)果。（圖18-6)。

圖18-6　Southernblot體系

前述分離、純化的DNA樣品5-10μg/100μlTE，加限制性內(nèi)切酶3Unit/1μgDNA和內(nèi)切酶相應(yīng)緩沖液，在相應(yīng)溫度保溫1-3小時（不同的酶所用的緩沖液和溫度不同)，乙醇沉淀，15-20μl TE溶解DNA斷片。前述電泳條件，與DNA分子量標準品（Marker，Ladder)一起，3-4V/cm電泳（30V12-15小時)。在紫外光下觀察Marker充分分離，結(jié)束電泳。將膠放入0.5mol/l NaCl，0.5mol/L NaOH液體中30分鐘，使DNA變性。同時將膜用蒸餾水浸潤，在0.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH液體的方盤皿上，放上濾紙兩頭浸在液體中，依次放上凝膠、膜、濾紙、一尺厚的吸水紙，壓力1kg的重物。轉(zhuǎn)移（印跡，blot)過夜。翌日，把膜放在0.5mol/l Tris-HCl，pH7.0-7.5，1mol/L NaCl液中，中和膜上堿性變性液15-30分鐘。戴上手套，用手指壓在膜上來回充分洗膜。室溫干燥一小時。用塑料封口zxtf.net.cn/wszg/機，把膜和預(yù)雜交緩沖液封在塑料口袋中，注意驅(qū)除袋內(nèi)汽泡。熱水浴過夜。探針變性后，加入袋中再封口。熱水浴過夜。

（三)Northern blot

用于RNA分析，電泳條件與轉(zhuǎn)膜方法與Southern blot不同外，RNA不必變性與中和，電泳時加電醛防止RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成。其它步驟相同。

為了防止RNase水解需分析的mRNA，盡可能將器皿在160-180℃干熱滅菌8小時以上，也可加0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC)泡2小時，滅菌水淋洗干凈，100℃干烤15分鐘。不能干熱滅菌的試劑等，也可加1％DEPC處理12小時（但不能用于Tris)后，100℃。加熱15分鐘（或高壓滅菌15分鐘)以抑制、分解RNase。1.0g瓊脂糖，滅菌水80ml加熱溶解。加x50TAE2ml，EB25μl，滅菌水至1000ml。樣品緩沖液，x50TAE20μl，50％去離子甲酰胺500μl，甲醛180μl，混勻。約10-30μg/10μl純化的RNA樣品，加二倍（20μl)樣品緩沖液（可點樣一個凝膠孔lane)。60℃水浴15min，zxtf.net.cn/pharm/馬上置冰浴。加1/10電泳指示劑。點樣電泳，75-80V電泳4-5小時（指示劑泳動7～8cm)，結(jié)束電泳。電泳期間正負極緩沖液要不斷交換（可用蠕動泵)，以免pH改變。電泳結(jié)束，將凝膠放在紫外光下可觀察到人rRNA大亞基28S（5.1kb)，小亞基18S(2.0kb)，記下大小亞基移動距離（或拍照)，可作為被測mRNA分子量分析的參照物。凝膠在50mmol/l NaOH中變性30分鐘（低濃度堿，此步可省)。膜在10xSSPE中浸20分鐘。用10xSSPE轉(zhuǎn)移過夜（同Southern blot)。80℃1-2小時干燥。用探針雜交后，顯影或顯色。

（四)原位雜交（insituhybridization)

在保持細胞形狀條件下，進行細胞內(nèi)雜交，顯影或顯色。用于DNA或RNA分析。

細胞用離心涂片機涂片或組織切片置于載玻片上。4％多聚甲醛（PFA)/PBS固定（固定時間因標本而異10-20分鐘，也可用含2％甲醛，0.05％戊二醛，2.5mmol/lCaCl₂的0.1mol/L磷酸緩沖液pH7.3，500W微波爐中照射10-20秒，固定)。馬上用PBS洗標本三次，2.5μg/ml蛋白酶K，37℃，5-20分鐘（因標本和固定條件而定)處理。磷酸鹽類緩沖液（PBs NaCl 137mmol/l，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄8.1mmol/L，KH₂PO₄1.5mmol/L)洗滌。4％PFA/PBS后固定，PBS洗一次，0.2％甘氨酸/PBS洗二次，每次15分鐘。預(yù)雜交：42℃，1小時。預(yù)雜交緩沖液：10％硫酸葡聚糖，10％Denhardt液，0.5％吐溫－20，250μg/ml鮭魚精子DNA，500μg/ml酵母tRNA。雜交：42℃，4小時。用2x雜交緩沖液（4xSSC，0.2mol/L磷酸鈉pH6.5，2xDenhardt)溶解已標記探針，使其終濃度為0.1-1.0μg/ml。DNA檢測時把探針覆蓋在標本上，置100℃5分鐘（變性)取出，雜交。mRNA檢測則先把探針置95℃水浴3分鐘，立即置冰水浴，再覆蓋標本上進行雜交。覆蓋標本用液量100-200μl洗滌：2xSSC，50℃過夜。0.2xSSC，室溫1小時。載玻片浸在緩沖液中。顯色（試劑、方法參照斑點雜交的封閉-顯色部分)20分鐘-2小時，顯微鏡下觀察結(jié)果。

二、核酸擴增技術(shù)

通過大腸埃希菌繁殖而增殖重組質(zhì)粒，也是擴增核酸的手段。但在試管中有效擴增DNA的方法，是在90年代才開展起來的多聚酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR)新技術(shù)。由于PCR靈敏度高、特異性好、操作方便，在我國發(fā)展很快。目前，PCR技術(shù)結(jié)合分子生物學(xué)實驗技術(shù)（如逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)雜交技術(shù)等)開發(fā)了許多PCR新技術(shù)（reverse transcriptase PCR；PCR-single strandconformation polymorphism，PCR-SSCP；巢式PCR(二次PCR)；熱啟動PCR等)。RT-PCR用于RNA分析；PCR-SSCP分辨率高，可用于點突變分析；二次PCR特異性好，靈敏度高；熱啟動PCR可提高特異性。

PCR技術(shù)原理是在了解DNA一級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上設(shè)計引物（primer或sense，人工合成)，DNA多聚酶可識別并結(jié)合引物，以單鏈DNA為模板，dNTP為底物，合成其互補鏈。通過反復(fù)變性，反復(fù)合成互補鏈的過程，達到DNA擴增的目的。人的DNA擴增引物長度多為20個核甘酸。（圖18-7)

圖18-7　PCR技術(shù)原理

PCR反應(yīng)：DNA樣品0.1-1μg，引物1，2各25-100pmol，dNTP各200μmol/L，Tris-HCl（pH8.3)10mmol/L，KCl 50mmol/L，MgCl₂1.5mmol/L，gelatin（明膠)0.01％，Taq多聚酶2.5-5U，礦物油一滴。93℃7分鐘→50-55℃2分鐘→70-72℃3-1.5分鐘→93℃2分鐘。

將反應(yīng)物和Marker點樣于凝膠一起電泳，紫外光下觀察結(jié)果，拍照保存結(jié)果。反應(yīng)物也可用于印跡（雜交)實驗、多態(tài)分析、探針制備等。

注意事項：①DNA樣品純度高，Taq酶（和Klenow酶)有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，DNA和RNA不能混在一起。②設(shè)計的引物分子內(nèi)（特別3′端)和引物，1，2分子間不形成雙鏈。選擇性好，不增幅目的DNA以外區(qū)域的DNA。引物的G＋C含量為40％-60％。③dNTP濃度過高易使Taq酶合成錯誤，一般在200μmol/L，有人建議40-50μmol/L。④KCl＞75mmol/L對酶有抑制作用。Mg²⁺濃度過高，NDA不易變性，＞10mmol/L可抑制酶活性40％-50％。⑤多聚酶：Taq多聚酶從嗜熱菌分離得到（1989年，在此以前1985年利用Klenow酶因不耐熱每經(jīng)過一次熱變性要補加一次酶)，現(xiàn)在經(jīng)基因克隆的重組體產(chǎn)物Taq酶最適pH8.3～8.8（室溫8.3-8.4)，反應(yīng)溫度75-80℃，95℃以上失活明顯。無3′→5′校讀活性，對SDS敏感（＜0.01％活性也受到抑制，加吐溫－20可抵制SDS抑制)。該酶有逆轉(zhuǎn)錄酶活性。⑥退火溫度一般設(shè)定為Tm－5℃，但實際上與引物一級結(jié)構(gòu)序列有關(guān)，設(shè)計不當(dāng)可造成非特異性退火，而造成非特異擴增，此時應(yīng)調(diào)整溫度和相應(yīng)的時間。⑦循環(huán)次數(shù)受到的影響因素較多，增加次數(shù)可提高靈敏度，但易出現(xiàn)非特異擴增。⑧PCR靈敏高，被檢樣品極易被污染，樣品純化，擴增，檢測區(qū)域應(yīng)分開。房間應(yīng)經(jīng)常用紫外光照射。擴增物應(yīng)定點丟棄，處理。

三、核酸限制性片段長度多態(tài)性（RFLP)分析

RFLP分析是限制性內(nèi)切酶、核酸電泳、印跡（blot)技術(shù)、探針-雜交技術(shù)的綜合應(yīng)用，多用于臨床遺傳性疾病的基因診斷。基本原理是遺傳性疾病多有基因的缺陷，如基因缺失、基因插入、編碼區(qū)小范圍核苷酸序列改變或點突變等。前二者可將純化的正常人和病人DNA同時用限制性內(nèi)切酶切成片段，經(jīng)電泳分離、印跡、探針雜交等找到目的基因。由于患者基因的缺失或插入，造成被限制性內(nèi)切酶切開的片段（分子量)大小與正常人發(fā)生差異（限制性片段長度多態(tài))，使其電泳遷移率發(fā)生差異，而達到基因診斷的目的。小區(qū)域或點突變，可選用一個限制性內(nèi)切酶的切點正好在這一變異位置，使切割作用和正常人發(fā)生差異（如正常人基因可切斷而患者不能，或反之)，達到診斷目的�，F(xiàn)在PCR產(chǎn)物經(jīng)變性為DNA單鏈，用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，只要有一個核苷酸發(fā)生變異，其電泳遷移率就會改變，進行多態(tài)分析（PCR-SSCP)。實際上把基因的異常位置設(shè)計在PCR擴增區(qū)域內(nèi)，就能進行多態(tài)分析。（圖18-8)

核酸純化→內(nèi)切酶作用→電泳分離→Southern blot→探針-雜交→顯影，顯色

圖18-8　點突變Eco R1RFL

四、核酸一級結(jié)構(gòu)（核苷酸序列sequence)分析

核酸一級結(jié)構(gòu)分析是基因分析最直接的第一手資料。目前DNA、RNA以及蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)分析中，DNA的堿基序列分析方法多樣、簡單、快速。下面就M13噬菌體-雙脫氧核苷酸（ddNTP)的DNA測序法介紹如下。

M13是單鏈DNA噬菌體，轉(zhuǎn)染宿主菌體復(fù)制為雙鏈增殖，又以單鏈形式透出菌體。把待測DNA重組插入雙鏈M13復(fù)制型DNA中，經(jīng)培養(yǎng)擴增，可分離得到單鏈M13DNA（含待測單鏈DNA的堿基序列)，即復(fù)制模板。在待測DNA的3′端人工合成引物，在DNA聚合酶Ⅰ作用下，復(fù)制鏈延長。在ddNTP（2′,3′雙脫氧核糖核苷三磷酸)存在下，復(fù)制延長隨機受阻，形成分子量（長度)大小不等的片段。電泳分離，自顯影，讀圖18-9分析堿基序列。

圖18-9　核酸堿基序列分析

0.2-0.3mm厚度聚丙烯酰胺-尿素凝膠，高壓（1600V)電泳，可分辨一個核苷酸的差異。電泳后干燥凝膠，自顯影，自下往上讀圖，得到5′→3′的合成鏈堿基序列，其互補鏈是待測DNA的3′→5′堿基序列。