動脈粥樣硬化:第五節(jié)　LDL-R基因突變的常用研究方法

一、Southern印跡法

Southern印跡法在鑒定LDL-R基因缺失突變中得到了廣泛的應(yīng)用。采用多種限制性內(nèi)切酶切，以LDL-R基因片段和外顯子特異性片段作探針，進行雜交，再放射自顯影，對FH進行限制性酶切圖譜分析，可檢測FH患者的不同外顯子區(qū)域不同長度的部分缺失類型。

二、PCR法和核苷酸序列分析法

采用PCR法將包括點突變的受體基因片段擴增，再經(jīng)核苷酸序列分析即可發(fā)現(xiàn)點突變位點。影響酶切位點的點突變可經(jīng)PCR擴增、特定的限制性酶切、電泳，檢測出異常片段。

三、寡核苷酸探針法

本法采用的是一對寡核苷酸探針，其中一個與正�；�因順序互補，另一個與突變序列互補，因此需用到多種特異的寡核苷酸探針，是鑒定點突變的一種快速而簡便的方法，當一個或二個點突變在某一特定人群中成為突變的主要原因時，就可建立這種方法對某一地區(qū)的某一主要突變進行篩查。

四、RFLP連鎖分析法

限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment lengthpolymorphism,RFLP)是采用不同的限制性核酸內(nèi)切酶酶切和多種cDNA片段探針，根據(jù)DNA多態(tài)性片段的出現(xiàn)，確定LDL-R基因的連鎖相。

本法需進行家系分析，多態(tài)位點必須有一個以上是雜合的，并且要排除細胞減數(shù)分裂時基因重組對多態(tài)位點的影響。

五、長鏈PCR法

zxtf.net.cn/shiti/常規(guī)的PCR擴增長度不超過3kb，不適合檢測大片段的受體基因缺失突變，Southern印跡法亦繁瑣復(fù)雜，近年來長鏈PCR技術(shù)的研究為檢測LDL-R開辟了新途徑。下面詳細介紹由周天鴻等建立的長鏈PCR法在檢測LDL-R基因大片段缺失突型中的應(yīng)用。

引物：設(shè)計5對寡核苷酸引物，見表20-6。

表20-6 PCR擴增引物序列

DNA：由健康人和FH患者外周血制備DNA。

長鏈DNA擴增：采用引物PA1和PA2擴增LDL-R基因中外顯子5～10的片段。

PCR擴增制備探針：采用引物PB1/PB2、PC1/PC2、PD1/PD2、PE1/PE2制備LDL-R基因外顯子7、8、9、10的同位素探針。

PA1對應(yīng)于LDL-R基因外顯子5的5"端側(cè)翼序列，PA2對應(yīng)于外顯子10的部分序列，此對引物擴增產(chǎn)物為含外顯5～10的基因片段。正常人得到1條7kbDNA片段，F(xiàn)H患者得到2條DNA片段，一條7kb，一條4.4kb，表明FH患者是雜合子，其一個LDL-R等位基因正常，另一個等位基因外顯子5～10之間存在著一個2.6kb的缺失，見圖20-4。將產(chǎn)物用EcoR1酶切，得到的產(chǎn)物電泳圖譜見圖20-5。最后用PB、PC、PD、PE4對引物，以正常基因的長鏈PCR產(chǎn)物為模板，用PCR法獲得外顯子7、8、9、10的探針，將這些探針分別與正常基因的突變基因的長鏈PCR產(chǎn)物雜交，其結(jié)果見表20-7。

采用長鏈PCR技術(shù)可快速、簡單、準確地檢測大片段的缺失突變，可應(yīng)用于臨床基因診斷，尤其是有遺傳背景的FH高危人群的基因篩查。

圖20-4 FH患者LDL-R基因缺失示意圖

圖20-5 長鏈PCR產(chǎn)物電泳示意圖

a：FH患者基因PCR擴增產(chǎn)物；b：健康人基因PCR擴增產(chǎn)物；c：CNA分子量標記。

表20-7 LDL-R突變基因和正�；�因長鏈PCR產(chǎn)物與外顯子7～10探針的雜交結(jié)果

（劉芳)