臨床生物化學(xué):第二節(jié)　電泳技術(shù)的應(yīng)用

在直流電場中，帶電粒子向帶符號相反的電極移動的現(xiàn)象稱為電泳（electropho-resis)。1809年俄國物理學(xué)家Peнce首先發(fā)現(xiàn)了電泳現(xiàn)象，但直到1937年瑞典的Tiselius建立了分離蛋白質(zhì)的界面電泳（boundaryelectrophoresis)之后，電泳技術(shù)才開始應(yīng)用。本世紀(jì)60-70年代，當(dāng)濾紙、聚丙烯酰胺凝膠等介質(zhì)相繼引入電泳以來，電泳技術(shù)得以迅速發(fā)展。豐富多彩的電泳形式使其應(yīng)用十分廣泛。電泳技術(shù)除了用于小分子物質(zhì)的分離分析外，最主要用于蛋白質(zhì)、核酸、酶，甚至病毒與細(xì)胞的研究。由于某些電泳法設(shè)備簡單，操作方便，具有高分辨率及選擇性特點(diǎn)，已成為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中常用的技術(shù)。

一、電泳技術(shù)的基本原理和分類

在電場中，推動帶電質(zhì)點(diǎn)運(yùn)動的力（F)等于質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷量（Q)與電場強(qiáng)度（E)的乘積。

F＝QE

質(zhì)點(diǎn)的前移同樣要受到阻力（F)的影響，對于一個球形質(zhì)點(diǎn)，服從Stoke定律，即：

F′＝6πrην

式中r為質(zhì)點(diǎn)半徑，η為介質(zhì)粘度，ν為質(zhì)點(diǎn)移動速度，當(dāng)質(zhì)點(diǎn)在電場中作穩(wěn)定運(yùn)動時：

F＝F′即QE＝6πrην

上式交換后可寫成

ν/E的含意為單位電場強(qiáng)度下的移動速度，這里可用遷移率μ表示，即

從上式可見，球形質(zhì)點(diǎn)的遷移率，首先取決于自身狀態(tài)，即與所帶電量成正比，與其半徑及介質(zhì)粘度成反比。除了自身狀態(tài)的因素外，電泳體系中其它因素也影響質(zhì)點(diǎn)的電泳遷移率。

電泳法可分為自由電泳（無支持體)及區(qū)帶電泳（有支持體)兩大類。前者包括Tise-leas式微量電泳、顯微電泳、等電聚焦電泳、等速電泳及密度梯度電泳。區(qū)帶電泳則包括濾紙電泳（常壓及高壓)、薄層電泳（薄膜及薄板)、凝膠電泳（瓊脂、瓊脂糖、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠)等。

自由電泳法的發(fā)展并不迅速，因?yàn)槠潆娪緝x構(gòu)造復(fù)雜、體積龐大，操作要求嚴(yán)格，價格昂貴等。而區(qū)帶電泳可用各種類型的物質(zhì)作支持體，其應(yīng)用比較廣泛。本節(jié)僅對常用的幾種區(qū)帶電泳分別加以敘述。

二、影響電泳遷移率的因素

⒈電場強(qiáng)度 電場強(qiáng)度是指單位長度（cm)的電位降，也稱電勢梯度。如以濾紙作支持物，其兩端浸入到電極液中，電極液與濾紙交界面的紙長為20cm，測得的電位降為200V，那么電場強(qiáng)度為200V/20cm＝10V/cm。當(dāng)電壓在500V以下，電場強(qiáng)度在2-10v/cm時為常壓電泳。電壓在500V以上，電場強(qiáng)度在20-200V/cm時為高壓電泳。電場強(qiáng)度大，帶電質(zhì)點(diǎn)的遷移率加速，因此省時，但因產(chǎn)生大量熱量，應(yīng)配備冷卻裝置以維持恒溫。

⒉溶液的pH值溶液的pH決定被分離物質(zhì)的解離程度和質(zhì)點(diǎn)的帶電性質(zhì)及所帶凈電荷量。例如蛋白質(zhì)分子，它是既有酸性基團(tuán)（-COOH)，又有堿性基團(tuán)（-NH₂)的兩性電解質(zhì)，在某一溶液中所帶正負(fù)電荷相等，即分子的凈電荷等于零，此時，蛋白質(zhì)在電場中不再移動，溶液的這一pH值為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（isoelctric point，pI)。若溶液pH處于等電點(diǎn)酸側(cè)，即pH＜pl，則蛋白質(zhì)帶正電荷，在電場中向負(fù)極移動。若溶液pH處于等電點(diǎn)堿側(cè)，即pH＞pl，則蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，向正極移動。溶液的pH離pl越遠(yuǎn)，質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷越多，電泳遷移率越大。因此在電泳時，應(yīng)根據(jù)樣品性質(zhì)，選擇合適的pH值緩沖液。

⒊溶液的離子強(qiáng)度電泳液中的離子濃度增加時會引起質(zhì)點(diǎn)遷移率的降低。其原因是帶電質(zhì)點(diǎn)吸引相反符合的離子聚集其周圍，形成一個與運(yùn)動質(zhì)點(diǎn)符合相反的離子氛（ionic atmosphere)，離子氛不僅降低質(zhì)點(diǎn)的帶電量，同時增加質(zhì)點(diǎn)前移的阻力，甚至使其不能泳動。然而離子濃度過低，會降低緩沖液的總濃度及緩沖容量，不易維持溶液的pH值，影響質(zhì)點(diǎn)的帶電量，改變泳動速度。離子的這種障礙效應(yīng)與其濃度和價數(shù)相關(guān)�？捎秒x子強(qiáng)度I表示。

式中S表示溶液中離子種類，Ci和Zi分別表示每種離子的摩爾濃度與化合價。最常用I值在0.02-0.2之間。

⒋電滲在電場作用下液體對于固體支持物的相對移動稱為電滲（electro-osmosis)。其產(chǎn)生的原因是固體支持物多孔，且?guī)в锌山怆x的化學(xué)基團(tuán)，因此常吸附溶液中的正離子或負(fù)離子，使溶液相對帶負(fù)電或正電。如以濾紙作支持物時，紙上纖維素吸附OH^-帶負(fù)電荷，與紙接觸的水溶液因產(chǎn)生H₃O⁺，帶正電荷移向負(fù)極，若質(zhì)點(diǎn)原來在電場中移向負(fù)極，結(jié)果質(zhì)點(diǎn)的表現(xiàn)速度比其固有速度要快，若質(zhì)點(diǎn)原來移向正極，表現(xiàn)速度比其固有速度要慢，可見應(yīng)盡可能選擇低電滲作用的支持物以減少電滲的影響。

三、電泳分析常用方法

（一)醋酸纖維素薄膜電泳

醋酸纖維素是提纖維素的羥基乙酰化形成的纖維素醋酸酯。由該物質(zhì)制成的薄膜稱為醋酸纖維素薄膜。這種薄膜對蛋白質(zhì)樣品吸附性小，幾乎能完全消除紙電泳中出現(xiàn)的“拖尾”現(xiàn)象，又因?yàn)槟さ挠H水性比較小，它所容納的緩沖液也少，電泳時電流的大部分由樣品傳導(dǎo)，所以分離速度快，電泳時間短，樣品用量少，5μg的蛋白質(zhì)可得到滿意的分離效果。因此特別適合于病理情況下微量異常蛋白的檢測。

醋酸纖維素膜經(jīng)過冰醋酸乙醇溶液或其它透明液處理后可使膜透明化有利于對電泳圖譜的光吸收掃描測定和膜的長期保存。

⒈材料與試劑醋酸纖維素膜一般使用市售商品，常用的電泳緩沖液為pH8.6的巴比妥緩沖液，濃度在0.05-0.09mol/L。

⒉操作要點(diǎn)

⑴膜的預(yù)處理：必須于電泳前將膜片浸泡于緩沖液，浸透后，取出膜片并用濾紙吸去多余的緩沖液，不可吸得過干。

⑵加樣：樣品用量依樣品濃度、本身性質(zhì)、染色方法及檢測方法等因素決定。對血清蛋白質(zhì)的常規(guī)電泳分析，每cm加樣線不超過1μl，相當(dāng)于60-80μg的蛋白質(zhì)。

⑶電泳：可在室溫下進(jìn)行。電壓為25V/cm，電流為0.4-0.6mA/cm寬。

⑷染色：一般蛋白質(zhì)染色常使用氨基黑和麗春紅，糖蛋白用甲苯胺藍(lán)或過碘酸-Schiff試劑，脂蛋白則用蘇丹黑或品紅亞硫酸染色。

⑸脫色與透明：對水溶性染料最普遍應(yīng)用的脫色劑是5％醋酸水溶液。為了長期保存或進(jìn)行光吸收掃描測定，可浸入冰醋酸：無水乙醇＝30:70（V/V)的透明液中。

（二)凝膠電泳

以淀粉膠、瓊脂或瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳法稱為凝膠電泳。其中聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)普遍用于分離蛋白質(zhì)及較小分子的核酸。瓊脂糖凝膠孔徑較大，對一般蛋白質(zhì)不起分子篩作用，但適用于分離同工酶及其亞型，大分子核酸等應(yīng)用較廣，介紹如下：

⒈瓊脂糖凝膠電泳的原理概述瓊脂糖是由瓊脂分離制備的鏈狀多糖。其結(jié)構(gòu)單元是D-半乳糖和3.6-脫水-L-半乳糖。許多瓊脂糖鏈依氫鍵及其它力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束，構(gòu)成大網(wǎng)孔型凝膠。因此該凝膠適合于免疫復(fù)合物、核酸與核蛋白的分離、鑒定及純化。在臨床生化檢驗(yàn)中www.med126.com常用于LDH、CK等同工酶的檢測。

⒉瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的基本技術(shù)在一定濃度的瓊脂糖凝膠介質(zhì)中，DNA分子的電泳遷移率與其分子量的常用對數(shù)成反比；分子構(gòu)型也對遷移率有影響，如共價閉環(huán)DNA＞直線DNA＞開環(huán)雙鏈DNA。當(dāng)凝膠濃度太高時，凝膠孔徑變小，環(huán)狀DNA（球形)不能進(jìn)入膠中，相對遷移率為0，而同等大小的直線DNA（剛性棒狀)可以按長軸方向前移，相對遷移率大于0。

⑴設(shè)備與試劑：瓊脂糖凝膠電泳分為垂直及水平型兩種。其中水平型可制備低濃度瓊脂糖凝膠，而且制膠與加樣都比較方便，故應(yīng)用比較廣泛。核酸分離一般用連續(xù)緩沖體系，常用的有TBE（0.08mol/l Tris·HCl，pH8.5，0.08mol/L硼酸，0.0024mol/lEDTA)和THE（0.04mol/l Tris·HCl。pH7.8，0.2mol/L醋酸鈉，0.0018mol/lEDTA)。

⑵凝膠制備：用上述緩沖液配制0.5％-0.8％瓊脂糖凝膠溶液，沸水浴或微波爐加熱使之融化，冷至55℃時加入溴化乙錠（EB)至終濃度為0.5μg/ml，然后將其注入玻璃板或有機(jī)玻璃板組裝好的模子中，厚度依樣品濃度而定。注膠時，梳齒下端距玻璃板0.5-1.0mm，待脫凝固后，取出梳子，加入適量電極緩沖液使板膠浸沒在緩沖液下1mm處。

⑶樣品制備與加樣：溶解于TBE或THE內(nèi)的樣品應(yīng)含指示染料（0.025％溴酚藍(lán)或桔黃橙)、蔗糖（10％-15％)或甘油（5％-10％)，也可使用2.5％Fico Ⅱ增加比重，使樣品集中，每齒孔可加樣5-10μg。

⑷電泳：一般電壓為5-15V/cm。對大分子的分離可用電壓5V/cm。電泳過程最好在低溫條件下進(jìn)行。

⑸樣品回收：電泳結(jié)束后在紫外燈下觀察樣品的分離情況，對需要的DNA分子或特殊片段可從電泳后的凝膠中以不同的方法進(jìn)行回收，如電泳洗脫法：在紫外燈下切取含核酸區(qū)帶的凝膠，將其裝入透析袋（內(nèi)含適量新鮮電泳緩沖液)，扎緊透析袋后，平放在水平型電泳槽兩電極之間的淺層緩沖液中，100V電泳2-3小時，然后正負(fù)電極交換，反向電泳2分鐘，使透析袋上的DNA釋放出來。吸出含DNA的溶液，進(jìn)行酚抽提、乙醇沉淀等步驟即可完成樣品的回收。

其它還有低融點(diǎn)瓊脂糖法、醋酸銨溶液浸出法、冷凍擠壓法等，但各種方法都僅僅有利于小分子量DNA片段（＜1kb)的回收，隨著DNA分子量的增大，回收量顯著下降。

（三)等電聚焦電泳技術(shù)

等電聚焦（isoelectricfocusing，IEF)是60年代中期問世的一種利用有pH梯度的介質(zhì)分離等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。由于其分辨率可達(dá)0.01pH單位，因此特別適合于分離分子量相近而等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)組分。

⒈IEF的基本原理在IEF的電泳中，具有pH梯度的介質(zhì)其分布是從陽極到陰極，pH值逐漸增大。如前所述，蛋白質(zhì)分子具有兩性解離及等電點(diǎn)的特征，這樣在堿性區(qū)域蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷向陽極移動，直至某一pH位點(diǎn)時失去電荷而停止移動，此處介質(zhì)的pH恰好等于聚焦蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)（pl)。同理，位于酸性區(qū)域的蛋白質(zhì)分子帶正電荷向陰極移動，直到它們的等電點(diǎn)上聚焦為止�？梢娫谠摲椒ㄖ�，等電點(diǎn)是蛋白質(zhì)組分的特性量度，將等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)混合物加入有pH梯度的凝膠介質(zhì)中，在電場內(nèi)經(jīng)過一定時間后，各組分將分別聚焦在各自等電點(diǎn)相應(yīng)的pH位置上，形成分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶。

⒉pH梯度的組成pH梯度的組成方式有二種，一種是人工pH梯度，由于其不穩(wěn)定，重復(fù)性差，現(xiàn)已不再使用。另一種是天然pH梯度。天然pH梯度的建立是在水平板或電泳管正負(fù)極間引入等電點(diǎn)彼此接近的一系列兩性電解質(zhì)的混合物，在正極端吸入酸液，如硫酸、磷酸或醋酸等，在負(fù)極端引入堿液，如氫氧化鈉、氨水等。電泳開始前兩性電解質(zhì)的混合物pH為一均值，即各段介質(zhì)中的pH相等，用pH₀表示。電泳開始后，混合物中pH最低的分子，帶負(fù)電荷最多，pI₁為其等電點(diǎn)，向正極移動速度最快，當(dāng)移動到正極附近的酸液界面時，pH突然下降，甚至接近或稍低于PI₁，這一分子不再向前移動而停留在此區(qū)域內(nèi)。由于兩性電解質(zhì)具有一定的緩沖能力，使其周圍一定的區(qū)域內(nèi)介質(zhì)的pH保持在它的等電點(diǎn)范圍。pH稍高的第二種兩性電解質(zhì)，其等電點(diǎn)為pI₂，也移向正極，由于pI₂＞pI₁，因此定位于第一種兩性電解質(zhì)之后，這樣，經(jīng)過一定時間后，具有不同等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)zxtf.net.cn/shouyi/按各自的等電點(diǎn)依次排列，形成了從正極到負(fù)極等電點(diǎn)遞增，由低到高的線性pH梯度，如圖16-3所示。

⒊兩性電解質(zhì)載體與支持介質(zhì)理想的兩性電解質(zhì)載體應(yīng)在pI處有足夠的緩沖能力及電導(dǎo)，前者保證pH梯度的穩(wěn)定，后者允許一定的電流通過。不同pI的兩性電解質(zhì)應(yīng)有相似的電導(dǎo)系數(shù)從而使整個體系的電導(dǎo)均勻。兩性電解質(zhì)的分子量要小，易于應(yīng)用分子篩或透析方法將其與被分離的高分子物質(zhì)分開，而且不應(yīng)與被分離物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)或使之變性。

圖16－3　pH梯度形成示意圖

常用的pH梯度支持介質(zhì)有聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠等，其中聚丙烯酰胺凝膠為最常應(yīng)用。

電泳后，不可用染色劑直接染色，因?yàn)槌Ｓ玫牡鞍踪|(zhì)染色劑也能和兩性電解質(zhì)結(jié)合，因此應(yīng)先將凝膠浸泡在5％的三氯醋酸中去除兩性電解質(zhì)，然后再以適當(dāng)?shù)姆椒ㄈ旧��?/p>

（四)其他電泳技術(shù)

⒈IEF/SDS-PAGE雙向電泳法1975年O′Farrall等人根據(jù)不同組份之間的等電點(diǎn)差異和分子量差異建立了IEF/Sd S-PAGE雙向電泳。其中IEF電泳（管柱狀)為第一向，SDS-PAGE為第二向（平板)。在進(jìn)行第一向IEF電泳時，電泳體系中應(yīng)加入高濃度尿素、適量非離子型去污劑NP-40。蛋白質(zhì)樣品中除含有這兩種物質(zhì)外還應(yīng)有二硫蘇糖醇以促使蛋白質(zhì)變性和肽鏈?zhǔn)嬲埂?/p>

IEF電泳結(jié)束后，將圓柱形凝膠在SDS-PAGE所應(yīng)用的樣品處理液（內(nèi)含SDS、β-巰基乙醇)中振蕩平衡，然后包埋在SDS-PAGE的凝膠板上端，即可進(jìn)行第二向電泳。

IEF/SDS-PAGE雙向電泳對蛋白質(zhì)（包括核糖體蛋白、組蛋白等)的分離是極為精細(xì)的，因此特別適合于分離細(xì)菌或細(xì)胞中復(fù)雜的蛋白質(zhì)組分。

⒉毛細(xì)管電泳 Neuhoff等人于1973年建立了毛細(xì)管均一濃度和梯度濃度凝膠用來分析微量蛋白質(zhì)的方法，即微柱膠電泳，均一濃度的凝膠是將毛細(xì)管浸入凝膠混合液中，使凝膠充滿總體積的2/3左右，然后將其撳入約厚2mm的代用粘土墊上，封閉管底，用一支直徑比盛凝膠的毛細(xì)管更細(xì)的硬質(zhì)玻璃毛細(xì)管吸水鋪在凝膠上。聚合后，除去水層并用毛細(xì)管加蛋白質(zhì)溶液（0.1-1.0μl，濃度為1-3mg/ml)于凝膠上，毛細(xì)管的空隙用電極緩沖液注滿，切除插入粘土部分，即可電泳。

目前毛細(xì)管電泳分析儀的誕生，特別是美國生物系統(tǒng)公司的高效電泳色譜儀為DNA片段、蛋白質(zhì)及多肽等生物大分子的分離、回收提供了快速、有效的途徑。高效電泳色譜法是將凝膠電泳解析度和快速液相色譜技術(shù)溶為一體，在從凝膠中洗脫樣品時，連續(xù)的洗脫液流載著分離好的成分，通過一個連機(jī)檢測器，將結(jié)果顯示并打印記錄。高效電泳色譜法既具有凝膠電泳固有的高分辨率，生物相容性的優(yōu)點(diǎn)，又可方便地連續(xù)洗脫樣品。