流式細(xì)胞術(shù)對外周血白細(xì)胞的免疫熒光分析

　　外周血是臨床檢驗中的重要標(biāo)本。FCM分析外周白細(xì)胞的主要目的是了解各種白細(xì)胞的數(shù)目與分群情況。這些數(shù)字的變化與臨床的某些疾病有一定的關(guān)系。近年來，由于多種識別白細(xì)胞膜表面抗原的單克隆抗體的發(fā)現(xiàn)，以及對這些單克隆抗體的直接或間接熒光標(biāo)記物的出現(xiàn)，使得利用FCM的熒光組織化學(xué)分析獲得被測細(xì)胞的多指標(biāo)的更多、更準(zhǔn)確的信息，這無疑對警覺臨床和科研有很大幫助。本節(jié)　主要討論有關(guān)外周血的白細(xì)胞的免疫熒光標(biāo)記技術(shù)、數(shù)據(jù)分析及臨床應(yīng)用等方面的問題。

　　一、白細(xì)胞的免疫熒光標(biāo)記技術(shù)

　　1．白細(xì)胞抗原下面給出世界衛(wèi)生組織對白細(xì)胞抗原的統(tǒng)一命名，以及它們的分子量、對應(yīng)的單克隆抗體及反應(yīng)陽性的細(xì)胞（見表10-2)。

表10-2　WHO對白細(xì)胞分化抗原的命名

　　a：急性淋巴細(xì)胞性白血��；b：慢性淋巴細(xì)胞性白血病。

　　2．樣品的制備供FCM分析的樣品是單細(xì)胞懸液，而且大部分樣品都需經(jīng)熒光染色。樣品的制備方法大致有三種：①用熒光單克隆抗體染全血，隨后溶解紅細(xì)胞；②紅細(xì)胞溶解后染色；③通過梯度離心法分離出單個淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，再將之制成細(xì)胞懸液染色。

　�。�1)全血染色后溶解紅細(xì)胞：由于不少血液標(biāo)本具有生物危害性，用此方法可以將染色、溶解、固定、分析幾個步驟都在一個試管內(nèi)進(jìn)行，這樣減少轉(zhuǎn)換過程中的污染。而且此法比用梯度離心分離出單個核細(xì)胞更節(jié)　省時間。由于此法未將粒細(xì)胞去除，故在用FCM分析時，要注意排除粒細(xì)胞的干擾。

　　具體操作步驟如下：

　�、偃�血100～150μl，放入5ml試管，并用50～100μl PBS稀釋，總體積為200μl。]

　�、跓晒鈽�(biāo)記的單克隆抗體染色30min，4^℃（或放于冰上)。單克隆抗體的濃度因不同來源差異很大，但為了使用方便，可按其說明書配成每次實(shí)驗使用10μl。注意蔽光。

　　③用3～4μl冷BPS清洗。離心250×g（約每分鐘1500轉(zhuǎn))，5min，洗3次。注意每次用吸管將上清吸出，決不能傾倒去液！

　�、苡�2ml氯化銨液（配法見下)在室溫下溶解紅血球，約10min。若紅細(xì)胞完全被溶解，溶液由混濁變到透明。注意溶解程度的掌握十分重要：若溶解過分，則導(dǎo)致白細(xì)胞上抗原被破壞，或者某些敏感的細(xì)胞死亡而導(dǎo)致比例的改變。若溶解不徹底，大量紅細(xì)胞會影響對淋巴細(xì)胞的分析。這是因為淋巴細(xì)胞在分析圖像上與紅細(xì)胞群接近，在框出淋巴細(xì)胞群時，會把部分紅細(xì)胞框定于淋巴細(xì)胞內(nèi)。而紅細(xì)胞溶解不足或過度在很大程度上影響著分析結(jié)果。

　　【氯化銨液的配制】

　　Tris—氯化銨1×氯化銨

　　0.16mol/L 　NH₄Cl 　　0.38g/100ml　 　90ml 　　0.16mol/L　　NH₄Cl

　　0.17mol/L 　Tris 　　2.06g/100ml 　　10ml　　0.17mol/l 　　Tris

　　pH值7.56 　　　　　　　　　　　　　　　　pH值7.2

　　⑤紅細(xì)胞被徹底溶解，加入1ml PBS稀釋的0.5%甲醛，立即離心，洗3次，條件同步驟③。加入甲醛的目的是盡早固定細(xì)胞和細(xì)胞上的抗原，避免有生物危害的標(biāo)本到處污染。

　�、迣⑷旧�完成的細(xì)胞懸浮于0.5～1ml的0.1%甲醛溶液內(nèi)。置4^℃，蔽光，等待分析。經(jīng)固定后的細(xì)胞在冰箱內(nèi)可保存一周，這樣對工作的安排會帶來方便。醫(yī).學(xué) 全在.線,提供www.med126.com

　�。�2)紅細(xì)胞被溶解后再對白細(xì)胞染色：此方法的優(yōu)點(diǎn)是可以了解被染白細(xì)胞的數(shù)量以及存活率。但由于有時有些標(biāo)本比較敏感，溶解紅細(xì)胞后，還要經(jīng)過多個染色步驟，這樣容易造成抗原的喪失。此法具體步驟如下：

　　①室溫下放入14ml氯化銨在15ml的試管里。

　　②加入0.5～1ml全血，混合3～5min。

　�、哿⒓措x心100～150×g，并用PBS洗2次。

　�、馨准�(xì)胞計數(shù)，注意存活率應(yīng)在90%以上。做成每毫升含5×10⁶白細(xì)胞懸浮液。將細(xì)胞分配到5ml的試管，每試管0.2ml，即1×10⁶個細(xì)胞。

　�、轃晒鈽�(biāo)記的單克隆抗體染色30min，4^℃，避光。抗體濃度配制如前所述。

　�、轕BS洗3次后，用0.5%甲醛固定。方法如前。

　�。�3)用Ficoll—Hypaque 梯度離心法分離出單個核細(xì)胞：用此法可以分離骨髓細(xì)胞、淋巴結(jié)、扁桃體搗碎后的單細(xì)胞懸液等。血液標(biāo)本應(yīng)有抗凝劑。取血到分離不能超過6h。

　　①抗凝全血4～20ml，用等量PBS或Hanks液稀釋。

　　②稀釋血8或40ml置于15或50ml離心管內(nèi)，4或10ml Ficoll—Hypaque（或者等量的其它分離液，比重為1.007)從離心管底部輕輕加入到血的下面。這種方法對血的擾動較小，比將全血加到Ficoll上面為好。加完后，可以清楚看到Ficoll與全血之間有一明顯的分界線。注意在Ficoll快加完時應(yīng)特別小心，否則有可能加入氣泡攪混血樣，使血與分離液混合，達(dá)不到分離的目的。

　�、垭x心350～400g,30min。紅細(xì)胞、粒細(xì)胞以及死細(xì)胞將位于離心管底部，中間層的單個核細(xì)胞為淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和一些血小板。

　�、苋〕鲋虚g層中所有細(xì)胞，若在Ficoll中還有細(xì)胞也要取出，這也是單個核細(xì)胞（PBMC)。

　　⑤用PBS洗3次，第1次清洗時，可用較快速400×g離心10min。因為有可能中間層中混有一些ficoll，比重增加而細(xì)胞不易沉降。

　�、轕BMC計數(shù)，注意存活率應(yīng)高于90%。配成5×10⁶個/ml的細(xì)胞懸浮液。

　�、呷〕�0.2ml的懸浮液加入到5ml試管（內(nèi)含1×10⁶細(xì)胞)，用熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，方法如前。洗3次后固定。注意必須先染色后固定，固定后的細(xì)胞膜通透性改變，會導(dǎo)致熒光標(biāo)記的抗體進(jìn)入細(xì)胞中去，而在顯微鏡下觀察的染色效果則和死細(xì)胞一樣。當(dāng)用FCM分析時，則均為陽性而達(dá)不到檢驗?zāi)康摹＿@也是用FCM分析的細(xì)胞存活率應(yīng)高于90%的原因。

　　（4)熒光標(biāo)記抗體的細(xì)胞染色：如前所述，F(xiàn)CM分析被熒光標(biāo)記的抗體染色的細(xì)胞，在選擇熒光染料時必須注意這些熒光染料所需要的激發(fā)光波長是否與所使用的FCM的激發(fā)光譜相匹配。一般各個公司所采用的綠色熒光染料為FITC，而選用的紅色熒光染料卻不盡相同，有的用TRITC，有的用藻紅蛋白（PE)，所需要的激發(fā)光譜就不一樣，因而若因匹配不當(dāng)則會招致熒光抗體所染的細(xì)胞分析不出來，這是應(yīng)該注意的。

　　這里的標(biāo)本染色方法和免疫熒光法相同。下面僅說明一些具體的注意事項：

　�、僭谟瞄g接法染色時，染色步驟依次為第一抗體→清洗→第二抗體→清洗→紅細(xì)胞溶解。為了實(shí)驗的方便，將第二抗體也配成每次實(shí)驗用10μl。

　�、陔p色法：雙色法多用于直接染色法。將分別用FITC和PE標(biāo)記的抗體各10μl置入同一個含有約1×10⁶/0.2ml的試管內(nèi)，30min，4℃避光。然后清洗、固定。

　　目前不少制備單克隆抗體的公司已將比值有意義的兩種抗體，分別用紅、綠熒光染料標(biāo)記后，制成一種試劑。如CD₂—FITC/CD₂₀—PE；CD₄-FITC/CD₈-PE等�？砂凑f明使用，具體用量為每次實(shí)驗10μl。

　　③對照組：眾所周知，免疫組化的染色過程中，陰性和陽性對照是必不可少的。在準(zhǔn)備用FCM分析的細(xì)胞時，對照標(biāo)本的制備顯得格外重要。因為一次用FCM分析的樣品可能會很多，甚至多達(dá)上百個試管。對同一病人也可能會用到20～30個不同的單克隆抗體。每一個病人都要有相應(yīng)的陰性對照。陰性對照主要用于儀器分析細(xì)胞之前，設(shè)立陰性和陽性的分界線。陽性對照主要用于檢查染色方法。陽性對照細(xì)胞選自那些已知的細(xì)胞和已知的單克隆抗體中的陽性反應(yīng)最明顯者。陰性對照細(xì)胞有以下幾種：

　　1)非染色細(xì)胞：直接染色法時，用10μl PBS代替與熒光結(jié)合的單克隆抗體，其它步驟相同。間接染色法時，分別用10μl的PBS代替第一抗體和熒光第二抗體，其它步驟相同。

　　2)使用非特異性的抗小鼠膜表面免疫球蛋白（MsIg)，代替特異性的單克隆抗體。這是由于所使用的單克隆抗體來自小鼠，可能造成非特異性的假性反應(yīng)，因此使用MsIg作為對照。同時還需要注意選擇與實(shí)驗用單克隆抗體亞類一致的MsIg。如大部分單克隆抗體為IgG1，也有部分抗體為IgM，所以用MsIg作對照組時，往往使用MsIgG和MsIgM兩種。直接染色法時，用10μl與熒光結(jié)合的MsIg，代替熒光單克隆抗體。間接染色時，用10μl無熒光的MsIg代替第一抗體。其它步驟與實(shí)驗組相同。

　　3)雙染色對照：將各10μl 的分別與紅熒光染料和綠熒光染料結(jié)合的MsIgg 或MsIgM，加入到同一個試管，代替熒光的特異性單克隆抗體，其它步驟相同。

　　4)間接法對照：用10μl的PBS代替第一抗體。熒光第二抗體的濃度和使用量均與其它實(shí)驗相同，其它實(shí)驗步驟也和實(shí)驗組相同。

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