流式細胞術(shù)對外周血白細胞的免疫熒光分析

　　外周血是臨床檢驗中的重要標本。FCM分析外周白細胞的主要目的是了解各種白細胞的數(shù)目與分群情況。這些數(shù)字的變化與臨床的某些疾病有一定的關(guān)系。近年來，由于多種識別白細胞膜表面抗原的單克隆抗體的發(fā)現(xiàn)，以及對這些單克隆抗體的直接或間接熒光標記物的出現(xiàn)，使得利用FCM的熒光組織化學(xué)分析獲得被測細胞的多指標的更多、更準確的信息，這無疑對警覺臨床和科研有很大幫助。本節(jié)　主要討論有關(guān)外周血的白細胞的免疫熒光標記技術(shù)、數(shù)據(jù)分析及臨床應(yīng)用等方面的問題。

　　一、白細胞的免疫熒光標記技術(shù)

　　1．白細胞抗原下面給出世界衛(wèi)生組織對白細胞抗原的統(tǒng)一命名，以及它們的分子量、對應(yīng)的單克隆抗體及反應(yīng)陽性的細胞（見表10-2)。

表10-2　WHO對白細胞分化抗原的命名

　　a：急性淋巴細胞性白血病；b：慢性淋巴細胞性白血病。

　　2．樣品的制備供FCM分析的樣品是單細胞懸液，而且大部分樣品都需經(jīng)熒光染色。樣品的制備方法大致有三種：①用熒光單克隆抗體染全血，隨后溶解紅細胞；②紅細胞溶解后染色；③通過梯度離心法分離出單個淋巴細胞和單核細胞，再將之制成細胞懸液染色。

　�。�1)全血染色后溶解紅細胞：由于不少血液標本具有生物危害性，用此方法可以將染色、溶解、固定、分析幾個步驟都在一個試管內(nèi)進行，這樣減少轉(zhuǎn)換過程中的污染。而且此法比用梯度離心分離出單個核細胞更節(jié)　省時間。由于此法未將粒細胞去除，故在用FCM分析時，要注意排除粒細胞的干擾。

　　具體操作步驟如下：

　　①全血100～150μl，放入5ml試管，并用50～100μl PBS稀釋，總體積為200μl。]

　�、跓晒鈽擞浀膯慰寺】贵w染色30min，4^℃（或放于冰上)。單克隆抗體的濃度因不同來源差異很大，但為了使用方便，可按其說明書配成每次實驗使用10μl。注意蔽光。

　�、塾�3～4μl冷BPS清洗。離心250×g（約每分鐘1500轉(zhuǎn))，5min，洗3次。注意每次用吸管將上清吸出，決不能傾倒去液！

　�、苡�2ml氯化銨液（配法見下)在室溫下溶解紅血球，約10min。若紅細胞完全被溶解，溶液由混濁變到透明。注意溶解程度的掌握十分重要：若溶解過分，則導(dǎo)致白細胞上抗原被破壞，或者某些敏感的細胞死亡而導(dǎo)致比例的改變。若溶解不徹底，大量紅細胞會影響對淋巴細胞的分析。這是因為淋巴細胞在分析圖像上與紅細胞群接近，在框出淋巴細胞群時，會把部分紅細胞框定于淋巴細胞內(nèi)。而紅細胞溶解不足或過度在很大程度上影響著分析結(jié)果。

　　【氯化銨液的配制】

　　Tris—氯化銨1×氯化銨

　　0.16mol/L 　NH₄Cl 　　0.38g/100ml　 　90ml 　　0.16mol/L　　NH₄Cl

　　0.17mol/L 　Tris 　　2.06g/100ml 　　10ml　　0.17mol/l 　　Tris

　　pH值7.56 　　　　　　　　　　　　　　　　pH值7.2

　�、菁t細胞被徹底溶解，加入1ml PBS稀釋的0.5%甲醛，立即離心，洗3次，條件同步驟③。加入甲醛的目的是盡早固定細胞和細胞上的抗原，避免有生物危害的標本到處污染。

　　⑥將染色完成的細胞懸浮于0.5～1ml的0.1%甲醛溶液內(nèi)。置4^℃，蔽光，等待分析。經(jīng)固定后的細胞在冰箱內(nèi)可保存一周，這樣對工作的安排會帶來方便。醫(yī).學(xué) 全在.線,提供www.med126.com

　　（2)紅細胞被溶解后再對白細胞染色：此方法的優(yōu)點是可以了解被染白細胞的數(shù)量以及存活率。但由于有時有些標本比較敏感，溶解紅細胞后，還要經(jīng)過多個染色步驟，這樣容易造成抗原的喪失。此法具體步驟如下：

　�、偈覝叵路湃�14ml氯化銨在15ml的試管里。

　�、诩尤�0.5～1ml全血，混合3～5min。

　�、哿⒓措x心100～150×g，并用PBS洗2次。

　�、馨准毎�計數(shù)，注意存活率應(yīng)在90%以上。做成每毫升含5×10⁶白細胞懸浮液。將細胞分配到5ml的試管，每試管0.2ml，即1×10⁶個細胞。

　　⑤熒光標記的單克隆抗體染色30min，4^℃，避光�？贵w濃度配制如前所述。

　　⑥PBS洗3次后，用0.5%甲醛固定。方法如前。

　�。�3)用Ficoll—Hypaque 梯度離心法分離出單個核細胞：用此法可以分離骨髓細胞、淋巴結(jié)、扁桃體搗碎后的單細胞懸液等。血液標本應(yīng)有抗凝劑。取血到分離不能超過6h。

　�、倏鼓�全血4～20ml，用等量PBS或Hanks液稀釋。

　　②稀釋血8或40ml置于15或50ml離心管內(nèi)，4或10ml Ficoll—Hypaque（或者等量的其它分離液，比重為1.007)從離心管底部輕輕加入到血的下面。這種方法對血的擾動較小，比將全血加到Ficoll上面為好。加完后，可以清楚看到Ficoll與全血之間有一明顯的分界線。注意在Ficoll快加完時應(yīng)特別小心，否則有可能加入氣泡攪混血樣，使血與分離液混合，達不到分離的目的。

　�、垭x心350～400g,30min。紅細胞、粒細胞以及死細胞將位于離心管底部，中間層的單個核細胞為淋巴細胞、單核細胞和一些血小板。

　�、苋〕鲋虚g層中所有細胞，若在Ficoll中還有細胞也要取出，這也是單個核細胞（PBMC)。

　�、萦肞BS洗3次，第1次清洗時，可用較快速400×g離心10min。因為有可能中間層中混有一些ficoll，比重增加而細胞不易沉降。

　　⑥PBMC計數(shù)，注意存活率應(yīng)高于90%。配成5×10⁶個/ml的細胞懸浮液。

　�、呷〕�0.2ml的懸浮液加入到5ml試管（內(nèi)含1×10⁶細胞)，用熒光標記的單克隆抗體染色，方法如前。洗3次后固定。注意必須先染色后固定，固定后的細胞膜通透性改變，會導(dǎo)致熒光標記的抗體進入細胞中去，而在顯微鏡下觀察的染色效果則和死細胞一樣。當用FCM分析時，則均為陽性而達不到檢驗?zāi)康�。這也是用FCM分析的細胞存活率應(yīng)高于90%的原因。

　�。�4)熒光標記抗體的細胞染色：如前所述，F(xiàn)CM分析被熒光標記的抗體染色的細胞，在選擇熒光染料時必須注意這些熒光染料所需要的激發(fā)光波長是否與所使用的FCM的激發(fā)光譜相匹配。一般各個公司所采用的綠色熒光染料為FITC，而選用的紅色熒光染料卻不盡相同，有的用TRITC，有的用藻紅蛋白（PE)，所需要的激發(fā)光譜就不一樣，因而若因匹配不當則會招致熒光抗體所染的細胞分析不出來，這是應(yīng)該注意的。

　　這里的標本染色方法和免疫熒光法相同。下面僅說明一些具體的注意事項：

　�、僭谟瞄g接法染色時，染色步驟依次為第一抗體→清洗→第二抗體→清洗→紅細胞溶解。為了實驗的方便，將第二抗體也配成每次實驗用10μl。

　�、陔p色法：雙色法多用于直接染色法。將分別用FITC和PE標記的抗體各10μl置入同一個含有約1×10⁶/0.2ml的試管內(nèi)，30min，4℃避光。然后清洗、固定。

　　目前不少制備單克隆抗體的公司已將比值有意義的兩種抗體，分別用紅、綠熒光染料標記后，制成一種試劑。如CD₂—FITC/CD₂₀—PE；CD₄-FITC/CD₈-PE等�？砂凑f明使用，具體用量為每次實驗10μl。

　�、蹖φ战M：眾所周知，免疫組化的染色過程中，陰性和陽性對照是必不可少的。在準備用FCM分析的細胞時，對照標本的制備顯得格外重要。因為一次用FCM分析的樣品可能會很多，甚至多達上百個試管。對同一病人也可能會用到20～30個不同的單克隆抗體。每一個病人都要有相應(yīng)的陰性對照。陰性對照主要用于儀器分析細胞之前，設(shè)立陰性和陽性的分界線。陽性對照主要用于檢查染色方法。陽性對照細胞選自那些已知的細胞和已知的單克隆抗體中的陽性反應(yīng)最明顯者。陰性對照細胞有以下幾種：

　　1)非染色細胞：直接染色法時，用10μl PBS代替與熒光結(jié)合的單克隆抗體，其它步驟相同。間接染色法時，分別用10μl的PBS代替第一抗體和熒光第二抗體，其它步驟相同。

　　2)使用非特異性的抗小鼠膜表面免疫球蛋白（MsIg)，代替特異性的單克隆抗體。這是由于所使用的單克隆抗體來自小鼠，可能造成非特異性的假性反應(yīng)，因此使用MsIg作為對照。同時還需要注意選擇與實驗用單克隆抗體亞類一致的MsIg。如大部分單克隆抗體為IgG1，也有部分抗體為IgM，所以用MsIg作對照組時，往往使用MsIgG和MsIgM兩種。直接染色法時，用10μl與熒光結(jié)合的MsIg，代替熒光單克隆抗體。間接染色時，用10μl無熒光的MsIg代替第一抗體。其它步驟與實驗組相同。

　　3)雙染色對照：將各10μl 的分別與紅熒光染料和綠熒光染料結(jié)合的MsIgg 或MsIgM，加入到同一個試管，代替熒光的特異性單克隆抗體，其它步驟相同。

　　4)間接法對照：用10μl的PBS代替第一抗體。熒光第二抗體的濃度和使用量均與其它實驗相同，其它實驗步驟也和實驗組相同。

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