3．雙染色分析游標設立和熒光校正
�。�1)游標的設立：游標設立的原理和單染并無不同，但具體要用二維點圖和二維等高圖來完成。分別選用GFL和RFL為X和Y軸。先用不染色細胞測試，將陰性細胞集中在左下角（圖10-13)。分別為X、Y軸設立游標，再用MsIg的陰性對照測試�？蓪、Y軸游標略為移動，使位于窗“3”內(nèi)的細胞（陰性)在95%以上。
�。�2)紅、綠熒光的校正：由于紅色熒光探測器在最佳測試狀態(tài)時，會讓部分綠色熒光進入紅色熒光探測器。這是因為一部分細胞發(fā)出的綠色熒光波長較長。若用阻斷或濾色的辦法消除進入紅熒光探測器的這部分GRL，就會大大地降低RFL探測器的靈敏度。因而只好在操作時，通過電子計算機預先進入熒光校正，在RFL中適當扣除GRL的影響。
通常紅色熒光進入綠色熒光探測器的情況比較光見，圖10-14給出CD11-PE（T細胞、RFL)及CD8-FITC（T抑制細胞，GFL)雙染細胞在二維等高圖上進行熒光校正的示意圖。X軸為GFL，Y軸為RFL，由X軸Y軸游標劃分的四個窗的陰陽性和圖10-13相同。各窗給出的百分數(shù)為該細胞群所占百分比。圖A表示未經(jīng)校正時的情形。窗“2”內(nèi)31.46%表示雙陽性細胞，即在T細胞中31.46%為抑制細胞毒細胞。經(jīng)過適當校正，可見有兩群陽性雙標記細胞出現(xiàn)（B圖)。高強度部分為真正的CD8、CD11雙標記陽性細胞；低強度部分屬于CD8綠色陽性細胞（NK細胞)。此時“2”窗中細胞份額減為7.59%。需要指出的是校正過度則會使各區(qū)的陽性細胞都減少（圖C)。
圖10-13 雙染色二維點圖上游標的設置
1區(qū)：紅色熒光陽性；2區(qū)�。杭t、綠熒光均為陽性；3區(qū)：陰性細胞：4區(qū)：綠色熒光陽性細胞
圖10-14雙染色在二維等高圖上熒光校正
雙染色的熒光校正是用電子補償電路來完成的。補償時先測定一種染料的熒光，此時除了應該接收該熒光的光電倍增管PMT1有信號輸出外，另一光電倍增管PMT2也常會有微弱輸出。調(diào)節(jié) 補償器使PMT2的輸出為0；然后再測另一種波長的熒光染料，調(diào)PMT１的補償器使之輸出也為0；然后再測另一種波長的熒光的染料，調(diào)PMT1的補償器使之輸出也為0：如此反復調(diào)節(jié) ，使兩種熒光的探測器都獲得補償。實際調(diào)節(jié) 時用的是一種標準熒光微球，微球上標有已知數(shù)量的熒光分子。利用不同的微球可調(diào)整、補償不同熒光的測量通道。需要指出的是：當PMT高壓有所改變、激光和濾片系統(tǒng)有所變動時，都要對熒光校正做重新補償調(diào)節(jié) 。
