從化學(xué)和生物學(xué)的意義上理解,探針是一種已知特異性的分子,它帶有合適的標(biāo)記物供反應(yīng)后檢測。探針和靶的相互反應(yīng)如抗原-抗體、血凝素-碳水化合物、親合素-生物素、受體和配體,以及核酸與其互補核酸間的雜交等反應(yīng)均屬此類。用核酸探針與待檢標(biāo)本中核酸雜交,形成雜交體,再用呈色反應(yīng)顯示。此方法用于疾病的診斷,稱為分子雜交基因診斷。此法開始用于遺傳性疾病的診斷如血紅蛋白病的診斷、先天性遺傳病的產(chǎn)前診斷。近來,已發(fā)展為診斷外源性病原體如病毒、細(xì)菌、原蟲等的方法;內(nèi)源性病變基因研究如癌基因檢測、基因突變、基因缺失或變異引起的疾病的基因診斷;人類基因識別及其生理功能和衰老有關(guān)研究;在法醫(yī)檢測中有關(guān)性別鑒別和DNA指紋譜的鑒定;蛱结樀难芯恳鹆巳藗兏叨戎匾暎谔结樀闹苽浼夹g(shù)上有重大突破。可將核酸分子探針檢測比喻為在柴草堆中去找一根針的神奇技術(shù)。據(jù)美國華爾街分析家預(yù)言:“在生物技術(shù)市場中,下一個突破和具有吸引力的是基因探針”。它的巨大的開發(fā)潛力和經(jīng)濟效益,已引起人們的重視。
目前基因檢測方法中以同位素標(biāo)記(32P、35S等)DNA探針靈敏度最高,但由于放射性污染、半衰期短、需要特別的安全防護條件等,限制了同位素標(biāo)記探針的廣泛應(yīng)用。因此,非同位素標(biāo)記探針的研制引起重視,自Langer等(1981)合成了生物素化dUTP和NTP類似物以來,開創(chuàng)了用非同位素標(biāo)記的新領(lǐng)域,用生物素標(biāo)記核酸探針檢測和識別特定的核酸序列,已廣泛應(yīng)用于臨床檢驗和科學(xué)研究。Leary等(1983)用缺口平移法標(biāo)記的生物素DNA探針成功地用于Southern印跡雜交技術(shù)。Forst等(1985)發(fā)表了光敏生物素直接標(biāo)記核酸的簡便方法,使核酸和蛋白質(zhì)的生物素標(biāo)記探針技術(shù)前進一大步。Renz 等(1984)、Thorpe 等(1985)和Pollars 、Knight等(1990)用化學(xué)法直接把辣根過氧化物酶接到DNA上,運用發(fā)光顯影法提高了敏感性。Muh-legger等(1990)用地高辛(Digoxigenin)標(biāo)記DNA,再用地高辛抗體連接堿性磷酸酶,催化發(fā)光底物金剛烷脫磷并發(fā)光,靈敏度與32P標(biāo)記探針相同,而且32P、標(biāo)記的DNA探針雜交膜需要在-70℃件下曝光4~7天于X光片上顯影,堿性磷酸酶發(fā)光法只需10~30min,十分快速、簡便。
基zxtf.net.cn/kuaiji/因診斷的被檢測基因或目的基因存在于樣品中,先將樣品中核酸提取出來,或在原位,或?qū)悠伏c在硝酸纖維素濾膜上,再經(jīng)蛋白酶處理,或酶切成較小的片段,經(jīng)變性處理(熱或堿變性)成單鏈。另一方面制備已知核酸序列標(biāo)記的核酸分子探針,也經(jīng)變性成單鏈。根據(jù)核酸鏈之間堿基配對的原理,將此核酸探針與樣品中核酸單鏈結(jié)合成雙鏈核酸,即稱分子雜交。被檢樣品形成雜交雙鏈,顯示陽性結(jié)果。如樣品無與探針互補的序列,則不發(fā)生分子雜交,結(jié)果為陰性。這種技術(shù)用于診斷要依靠基因探針,可見基因探針是基因診斷中的關(guān)鍵性試劑。
核酸探針傳統(tǒng)的標(biāo)記物是用放射性同位素,多用32PdNTP、3HdNTp 、35SdNTP等。用放射性同位素標(biāo)記核酸有以下優(yōu)點:
(1)靈敏性高:一般可達(dá)到0.5~5pg或更低濃度核酸的檢測水平,可以檢測極少量或拷貝數(shù)少的基因組(可延長曝光時間或增敏屏增敏)。
(2)特異性高:用放射自顯影法,樣品中存在的無關(guān)核酸或非核酸成分不會干擾檢測結(jié)果,準(zhǔn)確率高,假陽性率低。
(3)方法簡便。所以,放射性同位素標(biāo)記核酸探針在一些有條件的單位,作為主要的標(biāo)記方法仍在使用。
放射性同位素標(biāo)記技術(shù)也存在以下缺點:
①半衰期短,必須經(jīng)常標(biāo)記探針:如32P、半衰期只有14.3天,放射強度逐日變化。35S的半衰期可達(dá)88天,但衰變能量只有32P的1/10,靈敏度較低,只能用于多拷貝基因的檢測。3H的半衰期雖長達(dá)12.26年,但衰變能低,靈敏度太低。
②費用高:α-32P標(biāo)記的dATP(400Ci/mmol),需要進口試劑,價格高。
③檢測時間長:用放射自顯影需要較長的曝光時間(1zxtf.net.cn/yaoshi/~15天)。
④放射性同位素對人體有害,實驗室和環(huán)境易被污染,放射性廢物處理困難。因此,推廣使用受到限制。
所以研究非放射性標(biāo)記核酸探針及其檢測顯示方法、為推廣應(yīng)用基因診斷創(chuàng)造有利的條件,已成為80年代以來各國十分重視的研究目標(biāo)。這項技術(shù)屬生物高技術(shù)中發(fā)展很快、前景很大的項目。美國科學(xué)家于1981年首先合成了生物素標(biāo)記的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸,他們采用缺口平移制成生物素化核酸探針,成功地用于探測一系列基因。隨后美國的BRL和Enzo biochem 生產(chǎn)了這種生物素標(biāo)記探針及分子雜交成套試劑盒。1985年澳大利亞合成了光敏生物素,用于直接標(biāo)記核酸,這是Adelaide大學(xué)Forest等學(xué)者的重大成功。該大學(xué)的Bresatec 公司和美國的Vector實驗室,先后完成了配套試劑盒。1988年西德Boehring – Mannheim公司研制成功地高辛(半抗原)-抗體-酶法基因探針試劑盒。1989年我國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院馬立人教授等合成光敏生物素并研制成功光敏生物素核酸探針標(biāo)記和檢測試劑盒。至今,在國內(nèi)外市場上已有多種商品化非放射性標(biāo)記核酸探針試劑盒供應(yīng)。
利用核酸探針雜交技術(shù)比用免疫學(xué)抗原抗體技術(shù)有更高的特異性和敏感性等優(yōu)點,已顯示出巨大的發(fā)展?jié)摿。許多核酸(基因)探針已直接用于基因檢測,疾病診斷和病因研究。正在迅速發(fā)展的基因診斷更需要制作各種基因探針。因此,學(xué)習(xí)和研究制備核酸探針技術(shù)象制備各種單克隆抗體探針一樣已成為90年代大力發(fā)展的高技術(shù),也是分子醫(yī)學(xué)發(fā)展的熱點之一。
核酸探針制備技術(shù)包括目的基因的制備,放射性同位素標(biāo)記或非放射性標(biāo)記,標(biāo)記核酸的純化、鑒定、分裝、貯存等。本文介紹常用核酸探針的制備技術(shù),供初學(xué)者參考,更詳細(xì)的了解請參考有關(guān)專著。這項技術(shù)正在發(fā)展中,新方法不斷出現(xiàn),要密切注視文獻(xiàn)進展。