核酸分子探針的制備首先需要獲得所要的特異性核酸或其片段?捎靡韵路椒ㄖ苽www.med126.com:
(1)直接分離基因核酸:即從基因組上直接用內(nèi)切酶切下所需基因。
(2)化學(xué)合成基因核酸:即以單核苷酸為原料,以固相磷酸三酯法合成某一結(jié)構(gòu)完全清楚,分子量較小的寡核苷核。
(3)酶促合成核酸:在真核細(xì)胞中獲得特異的結(jié)構(gòu)基因。常用方法是以mRNA為模板,利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈cDNA,再以大腸桿菌DNA聚合酶I合成雙鏈的結(jié)構(gòu)基因。
(4)RNA探針。
在獲得特異的目的基因后,可用以下方法大量擴(kuò)增制備:①用體外DNA重組技術(shù)與載體DNA相連,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中進(jìn)行無(wú)性繁殖。以氯化銫超速離心純化重組質(zhì)粒DNA,并以合適限制性?xún)?nèi)切酶消化,經(jīng)凝膠電泳制備回收特異的目的核酸片段。②聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Poly-merase chain reaction, PCR)擴(kuò)增技術(shù):利用這種先進(jìn)技術(shù)能簡(jiǎn)便快速制備大量特異性目的核酸片段。PCR技術(shù)的基本原理是利用DNA聚合酶依賴(lài)于DNA模板的特征,在體外用一對(duì)和欲擴(kuò)增DNA片段的兩側(cè)序列互補(bǔ)的引物誘發(fā)聚合反應(yīng),即雙鏈DNA先高溫變性,然后在低溫下與引物退火,再在中等溫度進(jìn)行鏈延伸反應(yīng)。上述在三種不同溫度下的變性、退火和延伸為一個(gè)循環(huán)反應(yīng),重復(fù)這種循環(huán)反應(yīng)可使DNA獲得指數(shù)性倍增,例如經(jīng)過(guò)35個(gè)循環(huán)反應(yīng),DNA可擴(kuò)增1×108倍以上。