實用免疫細胞與核酸:第二節(jié)　熒光抗體的制備

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熒光抗體是免疫熒光細胞化學的重要技術之一，制備高特異性和高效價的熒光抗體必須選用高質量的熒光素和高特異性高效價的免疫血清。一、熒光素熒光是指一個分子或原子吸收了給予的能量后即刻引起發(fā)光，停止能量供給，發(fā)光也瞬時停止（一般持續(xù)10-7～10-8s）�？梢援a生明亮…

熒光抗體是免疫熒光細胞化學的重要技術之一，制備高特異性和高效價的熒光抗體必須選用高質量的熒光素和高特異性高效價的免疫血清。

一、熒光素

熒光是指一個分子或原子吸收了給予的能量后即刻引起發(fā)光，停止能量供給，發(fā)光也瞬時停止（一般持續(xù)10-7～10-8s)。可以產生明亮熒光的染料物質，稱熒光色素。目前主要常用的熒光色素有以下3種：

（一)異硫氰酸熒光素（Fluoresceinisothiocyanate, GITC)

呈黃色、橙黃或褐黃色粉末或結晶，性質穩(wěn)定，在室溫下能保存2年以上，在低溫中可保存多年。易溶于水和酒精。最大吸收光譜為490～495nm，最大發(fā)射光譜為520～530nm，呈現(xiàn)黃綠色熒光，分子量為398.4（圖3-5)。

在堿性條件下，F(xiàn)ITC的異硫氰酸基在水溶液中與免疫球蛋白的自由氨基經碳酰胺化而形成硫碳氨基鍵，成為標記熒光免疫球蛋白，即熒光抗體。反應式如下（圖3-6)：

一個Ig分子上最多能標記15～20個FITC分子。

圖3-5　FITC的吸收光譜和發(fā)射光譜

圖3-6　抗體的FITC標記反應式

（二)四乙基羅達明（tetraethylrodamineB200, RB200)

呈褐紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性質穩(wěn)定，可長期保存。最大吸收光譜為570nm，最大發(fā)射光譜為595～600nm,呈明亮橙紅色熒光。分子量為580（圖3-7)。

RB200在五氯化磷（PCl5)作用下轉變成磺酰氯（SO2Cl)，在堿性條件下易與蛋白質的賴氨酸ε-氨基反應結合而標記在蛋白分子上。化學反應式如下（圖3-8)。

圖3-7　RB200在可見光區(qū)的吸收

圖3-8　RB200標記抗體反應光譜和熒光光譜

（三)四甲基異硫氰酸羅達明（tetramethylrhodamineisothiocyanate, TMRITC)

它是一種紫紅色粉末，較穩(wěn)定。其最大吸收光譜為550nm，最大發(fā)射光譜620nm，呈橙紅色熒光，與FITC的黃綠色熒光對比清zxtf.net.cn/shiti/晰（圖3-9)，與蛋白質結合方式同TITC。它可用于雙標記示蹤研究�；瘜W結構式如下（圖3-10)。

圖3-9　TMRITC在可見光區(qū)的吸收光譜和發(fā)射光譜

圖3-10　 TMRITC結構式

二、熒光素標記抗體的方法

（一)FITC標記抗體的方法

1．Marsshall 氏法

（1)材料：抗體球蛋白溶液、0.5mol/l pH9.0碳酸鹽緩沖液、無菌生理鹽水、異硫氰酸熒光素、1%硫柳汞水溶液、三角燒瓶（25～50ml)、冰及冰槽（或1000ml燒杯)、電磁攪拌器、滅菌吸管、透析袋、玻棒、棉線及燒杯（500ml)、pH7.2或8.0的0.01mol/L PBS等。

（2)方法及步驟：

①抗體的準備：取適量已知球蛋白濃度之溶液，置入三角燒瓶中，加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液，使最后蛋白濃度為20mg/ml，緩沖液容量為總量的1/10，混勻，將三角燒瓶置冰槽中，電磁攪拌（速度適當以不起泡沫為宜)5～10min。

②熒光素的準備：根據(jù)欲標記的蛋白質總量，按每毫克蛋白加0.01mg 熒光素，用分析天平準確稱所取所需的異硫氰酸熒光素粉末。

③結合（或稱標記)：邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中，避免將熒光素粘于三角燒瓶壁或攪拌玻棒上（大約5～10min內加完)，加畢后，繼續(xù)攪拌12～18h。結合期間應保持蛋白溶液于4℃左右，故須及時添冰去水；亦可將結合裝置安放在4℃冰箱或冰庫中。

④透析：結合完畢后，將球蛋白的溶液離心（2500r/min)20min，除去其中少量之沉淀物，裝入透析袋中后再置于燒杯中，用pH8.0緩沖鹽水透析（0～4℃)過夜。

⑤過柱：取透析過夜的標記物，過葡聚糖凝膠G-25或G-50柱，分離游離熒光素，收集標記的熒光抗體進行鑒定（圖3-11，圖-3-12)。

圖3-11　 Sephadex G-25 對FITC

圖3-12　FITC與家兔IgG球蛋白在25℃和2℃時結合的動力學（Kawamura 1964)

洗脫液：0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.2);過濾量:12ml標記全球蛋白液(過濾前未透析);收集量:20ml(稀釋1.7倍)。

分別以1mgFITC溶于2份1mol 0.5mol/L碳酸重碳酸鹽緩沖液（分別為pH9.5和pH9.0)，于2℃下攪拌將其各加入100mg家兔IgG生理鹽水溶液中，攪勻后立即將每份分為兩半。一半保留于2℃下，另一半置25℃下。間隔一定時間后各取出0.5ml通過sephadex G-25去游離FITC，由上計算出5mg家兔IgG結合的FITC量。

2．Chadwick 氏法

（1)材料：抗原球蛋白溶液、異硫氰酸熒光素、3%重碳酸鈉水溶液、0.01mol/l Ph8.0磷酸鹽緩沖鹽水、1%硫柳汞、離心機及離心管、三角燒瓶（25ml)、冰槽、無菌吸管及毛細滴管、燒杯（500ml)、透析袋、棉線、玻棒等。

（2)方法及步驟：

①抗體準備：用0～4℃pH8.0磷酸鹽緩沖鹽水將球蛋白溶液稀釋至濃度為30～40mg/ml，置入三角燒瓶內，放于冰槽中。

②熒光色素準備：按每毫克蛋白加入熒光素0.01mg計算，稱取所需之熒光素量，用3%重碳酸鈉水溶液溶解。

③將準備之抗體與熒光色素溶液等量混合，充分攪勻，在0～4℃，冰箱中結合18～24h。

④透析和柱層析：方法同Marshall 氏法。

3．改良法（1963年) 　根據(jù)Marshall 氏法取高價的抗人球蛋白兔免疫血清，分離球蛋白，用鹽水（0.15mol/l NaCl)及緩沖液（0.15mol/l NaHCO3 –Na2CO3 PH9.0) 稀釋使每毫升內含蛋白10mg,緩沖液為總量的10%，降溫至4℃，加入異硫氰酸鹽熒光素，（蛋白：熒光素=50～80mg:1mg)，在0～4℃下電磁攪拌12～14h。然后用半飽和和硫酸銨將標記球蛋白沉淀分離，除去未結合的熒光素，再用緩沖鹽水透析，除去硫酸銨（用Nessler氏試劑測驗至隔夜透析之鹽水無氨離子及熒光色素為止)。將制備好的熒光抗體加疊氮鈉0.01%,分裝在1ml安瓿中，或凍干，保存于冰箱中（4℃)可以用半年以上，-20℃保存可達2年以上。

【附一】0.01mol/L pH7.2 PBS 配法：NaCzxtf.net.cn/wszg/l 18g 、Na2HPO41.5g、KH2PO40.2g,溶于2000ml蒸餾水中，校定pH至7.2。

【附二】0.5mol/L pH9.0碳酸鹽緩沖液配法：取0.5mol/l Na2CO3(5.3%)10ml加入0.5mol/l NaHCO3(4.2%)90ml,混合后，校定pH至9.0。

【附三】3%重碳酸鈉水溶液配法：稱1.5g無水重碳酸鈉充分溶解于50ml滅菌蒸餾水中即成。

4．透析標記法此法適用于小量抗體的熒光素標記，標記簡便，非特異性染色較少。

（1)用0.025mol/L碳酸鹽緩沖液pH9.0，將欲標記免疫球蛋白稀釋成1%濃度，裝入透析袋中。

（2)用同一緩沖液將FITC配成0.1mg/ml的溶液，按1%球蛋白液體積的10倍，將FITC稀釋液盛于圓柱形容器內，并使透析袋浸沒于FITC液中。容器頂端蓋緊，底部放攪拌棒，在4℃電磁攪拌下，透析標記24h。取出透析袋中標記液，即刻用sephadex G-50 凝膠過濾，去除游離熒光素，分裝、貯存于4℃中（圖3-13)。

圖3-13　標記抗體溶液通過sephadex 產膠柱層析分布

（二)四乙基羅達明標記抗體方法

取1g RB200及PCL52g放在乳缽中研磨5min（在通風櫥中)。然后加入10ml無水丙酮，放置5min，不斷攪拌。過濾，用濾液進行標記抗體。剩余部分吸附在濾紙上，4℃干燥保存。

取抗體（20mg/ml)每毫升加入生理鹽水和0.5mol/l pH9.0的碳酸鹽緩沖液各1ml稀釋。逐滴加入0.1ml RB200溶液，邊加入邊攪拌，在0～4℃中結合12～18h，再用生理鹽水透析5～7h，經葡聚糖凝膠G-50柱層析，除去游離熒光素，分裝，貯存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

（三)四甲基異硫氰酸羅達明標記抗體方法

（1)Igg 10ml (6mg/ml)在0.01mol/l pH9.5碳酸鹽緩沖液中透析過夜。

（2)將四甲基異硫近氰酸羅達明（每毫克IgG加入5～20μg)溶于二甲亞砜（1mg/ml),取此溶液300μl，一滴一滴加入蛋白質溶液中，同時電磁攪拌。

（3)在室溫中攪拌2h，避光。

（4)把結合物移入直徑3cm,高30cm大小的Bio –Gel P-6層析柱（用0.01mol/l pH8.0的PBS平衡過)，流速為1.5ml/min。

（5)收集先流出的紅色結合物，即為標記抗體，分裝，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（四)藻紅蛋白標記抗體的方法

1．巰基化藻紅蛋白（phycoerthrin PE)的制備，600μl的15.5mg/ml鹽酸巰醇亞胺（iminothiolane hydrochloride)加到1.2ml的3.6mg/ml的PE中，和1.2ml PB、pH6.8 混合，裝入透析袋置入50mmol/l pH6.8 PB中透析，4℃過夜，再換用pH7.5PB透析6h。每個PE分子中可結合8個巰基。

2．PE-IgG制備異雙功能試劑SPDP[n - Succ - inimdyl3-(2-pyridyldlthio) propinate ] 30μl (1.1mg/ml)的乙醇溶液，加入700μl的4.2mg/ml IgG PB溶液（50mmol/l pH7.5)，在室溫中反應2.5h。再加入巰基化Pe 400μl（1.7mg/ml)加到500μl反應混合液中，室溫反應12h，加入100μl的50mmol/L碘乙酸鈉封閉殘余巰基，用PB透析過夜，4℃。加入0.01%Na3N3分裝，4℃保存半年。

（五)PE-標記蛋白A方法

（1)取4.08mg PE溶于0.1mol/l pH7.4PB（含0.1mol/l NaCl)1ml中，溶解后，取出0.5ml，再加入10μlSPDP無水甲醇液（2.65mg/ml),SPDP/蛋白摩爾比為10，22℃反應5min，過Sephadex G-50(1×17cm),用100mmol/l pH7.4 PBS（含0.1mol/l NaCl)平衡和洗脫。

（2)0.5ml蛋白（2mg/ml)100mmol/l PB(含有100mmol/l NaCl) pH7.4，加入2.6μl上述SPDP甲醇液，SPDP：蛋白=9.5,22℃,40min ,加入25μmol/L二硫蘇糖醇（DTT)pH7.4緩沖液，22℃，25min，同上過Sephadex G-50，收集蛋白A峰。

（3)取0.77mg/ml的PE和0.27mg/ml蛋白A等量混合，22℃反應6h，混合物4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以上兩種PE標記制品，可最后溶于0.01mol/l pH7.4PB(含有0.1mol/l DETA、1mol/L碘乙酰胺、1%BSA 和0.1%NaN3),0～5℃保存。

（六)藍色熒光素標記抗體方法

Kbaffan等（1986)首先創(chuàng)立了藍色熒光素標記和染色技術，可進行雙標記或多標記。

（1)取7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methyl coumarin, AMC)260μg溶于二甲亞砜25μl中。

（2)將上液加入10ml IgG的巴比妥緩沖液（0.5mol/L,pH8.5,內含50～100mg IgG)中，室溫反應2h，過Sephadex G-50除去游離熒光素。

AMC呈黃色結晶固體，最大吸收波長354nm,最大熒光波長430nm。

三、熒光抗體質量控制

對制備的熒光抗體必須進行質量鑒定，主要進行特異性和敏感性兩個方面的鑒定。

（一)染色特異性和敏感性的測定

1．特異性染色效價的測定直接染色以倍比稀釋熒光抗體溶液如1：2，1：4，1：8……，與相應抗原標本作一系列染色，熒光強度在“+++”的最大釋釋度，即為該熒光抗體的染色滴度（效價)或單位。實際染色應用時，可取低一個或兩個稀釋度（即2～4個單位)，如染色效價為1：64，實際應用時可取1：32或1：16。間接染色效價可按抗核抗體熒光染色法步驟，先用不同稀釋度的熒光抗體染色，結果以抗核抗體熒光強度“++”為標準，染色用效價和直接法相同。

2．非特異性染色測定根據(jù)熒光抗體的用途不同，可用相類似的抗原切片或涂片，倍比稀釋熒光抗體，按常規(guī)染色，結果在標本上出現(xiàn)的非特異染色應顯著低于特異染色滴度，否則應采取消除非特異性染色的方法處理熒光抗體。

3．吸收試驗在熒光抗體中加入過量相應抗原，于室溫中攪拌2h后，移入4℃中過夜，3000r/min,離心30min，收集上清液，再用以染相應抗原陽性標本，結果應不出現(xiàn)明顯陽性熒光。

4．抑制試驗如前述。

（二)F/P比值的測定

F（熒光素)和P（抗體蛋白)的克分子比值反映熒光抗體的特異性染色質量，一般要求F/P的克分子比值為1～2。過高時，非特異性染色增強；過低時，熒光很弱，降低敏感性。

1．蛋白質定量測定熒光抗體的蛋白質mg/ml量。

2．結合熒光素定量　先制作熒光素定量標準曲線，即準確稱取FITC1mg,溶于10ml 0.5mol/L pH9.0碳酸鹽緩沖液中，再用0.01mol/l pH7.2PBS稀釋到100ml，此時熒光素含量為10 μg/ml，以此為原液，再倍比稀釋9個不同濃度的溶液，用分光亮度計在490nm波長測定光密度值（OD)，以光密度為縱坐標，熒光素含量為橫坐標，作標準函數(shù)圖。

熒光素與蛋白質結合后，其吸收光譜峰值向長波方向位移約5nm,FITC和蛋白質結合后由490nm變?yōu)?93～495nm，RB200和蛋白質結合后變?yōu)?95nm。

F/P比值的計算：可按以下公式計算。