外周血中單個(gè)核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，其體積、形態(tài)和密度與其他細(xì)胞不同，紅細(xì)胞和多核白細(xì)胞密度較大，為1.090左右，而淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞密度為1.07zxtf.net.cn/zhuyuan/5～1.090，血小板為1.030～1.035。為此利用一種密度介于1.075～1.092之間而近于等滲的溶液（分層液)做密度梯度離心，使一定密度的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離。常用的分層液有Ficoll和Percoll兩種。
（一)Ficoll分層液法
主要用于分離外周血中的單個(gè)核細(xì)胞，是一種單次密度梯度離心分離法。聚蔗糖－泛影葡胺是一種較理想的細(xì)胞分層液，其主要成分是一種合成的蔗糖聚合物稱聚蔗糖（商品名為Ficoll)，分子量為40kD，具有高密度、低滲透壓、無(wú)毒性的特點(diǎn)。高濃度的Ficoll溶液粘性高，易使細(xì)胞聚集，故通常使用60g/L的低濃度溶液，密度為1.020，添加比重為1.200的泛影葡胺（urografin)以增加密度。國(guó)外常用商品Isopaque或Hypaque，故又稱Ficoll-Hypaque分層液，將適量340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液中即可配制成密度合適分層液。分離人外周淋巴細(xì)胞以密度為1.077±0.001的分層液最佳，因?yàn)槿说募t細(xì)胞密度為1zxtf.net.cn/jianyan/.093，粒細(xì)胞密度為1.092，單個(gè)核細(xì)胞在1.076～1.090之間。而不同動(dòng)物血中的單個(gè)核細(xì)胞對(duì)分離液的密度要求各不相同，如小鼠為1.088，馬為1.090。分離時(shí)先將分層液置試管底層，然后將肝素化全血以Hanks液或PBS液作適當(dāng)稀釋后，輕輕疊加在分層液上面，使兩者形成一個(gè)清晰的界面。水平式離心后，離心管中會(huì)出現(xiàn)幾個(gè)不同層次的液體和細(xì)胞帶（圖20-1)。紅細(xì)胞和粒細(xì)胞密度大于分層液，同時(shí)因紅細(xì)胞遇到Ficoll而凝集成串錢狀而沉積于管底。血小板則因密度小而懸浮于血漿中，唯有與分層液密度相當(dāng)?shù)膯蝹�(gè)核細(xì)胞密集在血漿層和分層液的界面中，呈白膜狀，吸取該層細(xì)胞遞經(jīng)洗滌高心重懸。本法分離單個(gè)核細(xì)胞純度可達(dá)95％，淋巴細(xì)胞約占90％～95％，細(xì)胞獲得率可達(dá)80％以上，其高低與室溫有關(guān)，超過(guò)25℃時(shí)會(huì)影響細(xì)胞獲得率。
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圖20-1 Ficoll分層液離心后外周血細(xì)胞示意圖
（二)Percoll分層液法
這是一種連續(xù)密度梯度離心分離法。Percoll是一種經(jīng)聚乙烯吡喀烷酮(PVP)處理的硅膠顆粒，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性。利用Percoll液經(jīng)高速離心后形成一個(gè)連續(xù)密度梯度的原理，將密度不等的細(xì)胞分離純化。用Percoll原液(密度1.135)與約等量雙離子強(qiáng)度的磷酸緩沖液均勻混合，高速離心后，使分層液形成一個(gè)從管底到液面密度逐漸遞減的連續(xù)密度梯度，再將已制備的單個(gè)核細(xì)胞懸液輕輕疊加在液面上，低速離心后，便得四個(gè)細(xì)胞層。表層為死細(xì)胞殘片和血小板，底層為粒細(xì)胞和紅細(xì)胞，中間有兩層，上層富含單個(gè)核細(xì)胞(75％)，下層富含淋巴細(xì)胞(98％)(圖20-2)。該法是純化單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的一各較好的方法，但操作流程較長(zhǎng)，手續(xù)較多。
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圖20-2 連續(xù)密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞中各細(xì)胞成分的分布示意圖
