醫(yī)學論文范文:Toll樣受體2對角質(zhì)形成細胞分泌IL8的影響

1 材料和方法

1.1 主要試劑

鼠抗人TLR��2 mAb(Santa Cruz公司)、IL��8 ELISA檢測試劑盒(R&D System公司)、Triton X-100(Bebco公司)、KC-SFM和DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司)、牛膠原酶(Roche公司)、分散酶Dispase Ⅰ(Roche公司)、鼠抗人CK(AE1/AE3)、即用型SP免疫組化試劑盒單克隆抗體、即用型DAB酶底物試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)。

1.2 角質(zhì)形成細胞的原代培養(yǎng)

人角質(zhì)形成細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定參考文獻[2]，具體過程如下：取兒童包皮環(huán)切術(shù)后的新鮮包皮，0.1%新潔爾滅溶液消毒，磷酸緩沖液(PBS)清洗后，剪去多余的皮下組織;標本剪成皮片后浸入1.5 U/mL 的Dispase溶液中冷消化18～24 h，分離表皮和真皮，棄皮下組織和消化液;0.25%胰蛋白酶/EDTA消化液處理表皮，過濾殘渣，濾液離心后收集細胞;1%胎盼藍檢測細胞活力并計數(shù);按4×104 /cm2 的細胞密度接種，當細胞長滿皿底80%左右時，所得細胞直接用于實驗或繼續(xù)傳代;培養(yǎng)細胞經(jīng)CK的免疫組化染色方法鑒定;所有試驗取5代以內(nèi)的細胞。

1.3 白念珠菌(簡稱白念)的培養(yǎng)

白念標準株(ATCC 10231，中國醫(yī)學科學院皮膚病研究所真菌室友情提供)接種于37 ℃沙堡液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，試驗用對數(shù)生長期真菌;一個克隆形成單位定義為一個真菌細胞。

1.4 刺激實驗

實驗分為2組，A組：將細胞接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，長滿皿底80%左右時，直接加入白念活菌以及白念死菌(分別是細胞數(shù)的8倍)刺激角質(zhì)形成細胞。B組：每孔加入鼠抗TLR��2抗體20 μg/mL，孵育1 h，PBS洗滌，再分別加入上述刺激物，與角質(zhì)形成細胞孵育1、3、6、12、24 h時，取培養(yǎng)上清液，離心(5 000 r/min×5 min)，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｃ總�相同的刺激實驗做3復孔，同時設(shè)置陰性對照(添加培養(yǎng)基)。按照IL��8 ELISA檢測試劑盒說明進行操作，BIO�睷AD酶標儀測定樣品490 nm波長的OD值。

1.6 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)以SPSS 10.0軟件進行統(tǒng)計學處理，數(shù)值以(x±s)表示，兩組樣本采用t檢驗，三組及三組以上樣本之間的兩兩比較采用ANOVA檢驗。

2 結(jié)果

表1 中和前后實驗組與對照組IL��8濃度比較注：與對照組比較，^P<0.05

如表1所示，白念活菌刺激角質(zhì)形成細胞后IL��8升高，3 h開始，達到(567.3±113.6) pg/mL，24 h為(1 079.9±236.6 )pg/mL，達到高峰，與對照組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.01);而白念死菌刺激后，IL��8僅有輕度升高，與對照組比較沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。用抗TLR��2抗體中和TLR��2作用后，白念死菌刺激組IL��8升高不明顯(P>0.05)，而白念珠菌活菌刺激組IL��8仍明顯升高(P<0.01)，但是TLR��2抗體中和前后比較，IL��8水平無統(tǒng)計學差異(P>0.05)醫(yī).學全.在.線網(wǎng)站zxtf.net.cn。

3 討論

皮膚是機體防御外部環(huán)境中有害物質(zhì)入侵的第一道防線。作為表皮主要結(jié)構(gòu)的角質(zhì)形成細胞，除了構(gòu)筑防御病原微生物入侵的物理性屏障外，還通過分泌細胞因子、趨化因子和抗菌肽，向其他細胞傳遞信號,引起中性粒細胞、淋巴細胞的趨化;加速表皮細胞增殖，從而調(diào)節(jié)皮膚炎癥和免疫反應;并對入侵表皮的病原微生物有直接的殺傷作用，防止系統(tǒng)感染的出現(xiàn)。此外，紫外線、TL��1、TL��8、α�埠谒丶毎�刺激素(α�睲SH)可以增強角質(zhì)形成細胞的殺白念珠菌活性;前列腺素E2(PG E2)、血小板活化因子(platelet�瞐ctivating factor，PAF)也可能與殺傷作用有關(guān)[3]。

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