醫(yī)學(xué)微生物學(xué)-實(shí)驗(yàn)指導(dǎo):實(shí)驗(yàn)十八 病毒感染血清中抗體檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)十八  病毒感染血清中抗體檢測(cè)

病毒侵入機(jī)體后，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，并在血液中出現(xiàn)抗體，抗體在機(jī)體內(nèi)可持續(xù)存在一定時(shí)期。因此，應(yīng)用已知病毒測(cè)定抗體的存在和滴度，就可以協(xié)助診斷是否有病毒感染。如果只采取恢復(fù)期的血清，即使查到抗體也只說明過去有該病毒的感染，而不能確定最近的感染系由該病毒所引起。只有在疾病的早期和恢復(fù)期采取雙份血清檢測(cè)抗體，且恢復(fù)期抗體較早期血清抗體效價(jià)升高4倍或者以上時(shí)，再結(jié)合臨床表現(xiàn)，才有診斷價(jià)值。如能檢測(cè)到血清IgM抗體，則無需雙份血清，可達(dá)快速診斷的目的。

一、紅血球凝集及血球凝集抑制試驗(yàn)

某些病毒或病毒的血凝素能選擇地引起個(gè)別種類的哺乳類或禽類的紅細(xì)胞發(fā)生凝集，此即為紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。這種紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象可被病毒(或其血凝素)懸液中加進(jìn)特異性免疫血清或病人血清所抑制，即為紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)。在疾病發(fā)病早期和恢復(fù)期采取雙份血清。經(jīng)檢測(cè)，恢復(fù)期抗體較早期血清抗體效價(jià)升高4倍或以上時(shí)，再結(jié)合臨床表現(xiàn)，可作診斷依據(jù)。

（一)血凝試驗(yàn)(紅細(xì)胞凝集試驗(yàn))

【材料】

1．流感病毒雞胚尿囊液：將流感病毒接種于9～11d胚齡的雞胚尿囊腔內(nèi)(若初次分離物應(yīng)接種雞胚羊膜腔內(nèi))。37℃孵育48h，隨時(shí)觀察胚蛋活動(dòng)情況。溫箱內(nèi)應(yīng)保持一定濕度。48h后，雞胚若處于瀕死狀態(tài)時(shí)即收取尿囊液，3000r/min，離心15min，上清含血凝素。血凝素在-30℃保存，可保持其活性幾個(gè)月至幾年。

2．紅細(xì)胞：取雞血加入2%枸櫞酸鹽水，其比例為4∶1，迅速混合，存放于4℃冰箱，時(shí)間不超過一周。使用前取紅細(xì)胞懸液加5～10倍體積生理鹽水洗滌3次，最后一次以2000r/min的速度離心10min，洗滌后的紅細(xì)胞按容積用生理鹽水稀釋成0.5醫(yī).學(xué)全在線zxtf.net.cn%懸液備用。

表18-1 血凝試驗(yàn)操作方法（單位ml)

注：各管血凝結(jié)果以++++、+++、++、+、±、- 表示，自管底觀察。

一層紅細(xì)胞均勻鋪于管底者為++++。

基本同上，但邊緣不整齊，有下垂趨向者為+++。

血球于管底形成一個(gè)環(huán)狀，四周有小凝集塊者為++。

血球于管底形成一個(gè)小團(tuán)，但邊緣不整，四周有小凝塊者為+。

血球于管底形成一個(gè)小團(tuán)，邊緣光滑圓潤者為一。

【方法】

1．排列小試管10支，編號(hào)

2．按順次加入各種材料(表18-1)。

結(jié)果以++為終點(diǎn)，亦即一個(gè)凝集單位。做血凝抑制試驗(yàn)時(shí)，4個(gè)單位的血凝素即為++管向左移二管的稀釋度。如病毒的血凝稀釋度為1/640，則4個(gè)單位為1/160，將雞胚尿囊液用160倍稀釋即為4個(gè)單位。

（二)血凝抑制試驗(yàn)

【材料】

1．病人血清，流感病毒(4個(gè)血凝單位)，0.5%雞紅細(xì)胞

2．生理鹽水

3．試管、試管架、1ml吸管等

【方法】

1．排列11支小試管，編號(hào)。

2．按順次加入各種材料(表18-2)。

3．搖勻，置室溫60～90min，按血凝結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)判斷觀察結(jié)果，即在對(duì)照管均正常的條件下，不出現(xiàn)血凝的最高稀釋管的稀釋倍數(shù)即為血凝抑制抗體的效價(jià)。

表18-2 血凝抑制試驗(yàn)操作方法（單位ml)

二、中和試驗(yàn)

病毒中和試驗(yàn)是抗原抗體在試管中的中和反應(yīng)，通過接種動(dòng)物、雞胚培養(yǎng)或組織培養(yǎng)反映出來。原來病毒可對(duì)動(dòng)物、雞胚或組織培養(yǎng)致一定病變，由于經(jīng)特異性抗體中和而失去致病性。可用于檢查病人血清中抗體的增長，也可以用來鑒定未知病毒。常用于流行病學(xué)調(diào)查，在診斷一般疾病時(shí)不常用。試驗(yàn)時(shí)將病人血清作一系列遞增倍比稀釋后與已知病毒放入試管中作用一定時(shí)間，然后接種于易感動(dòng)物、雞胚或組織中，觀察一段時(shí)間。如果動(dòng)物不死(或雞胚不死，或細(xì)胞培養(yǎng)不出現(xiàn)病變)，則表示該病人血清中含有一定量的特異性中和抗體。說明病人曾受過該病毒的感染。

【材料】

1．Ⅰ型脊髓灰質(zhì)炎病毒，病人血清。

2．HeLa細(xì)胞培養(yǎng)瓶。

3．細(xì)胞維持液（含5%小牛血清，5%水解乳蛋白Hanks液)等。

【方法】

（一)病毒液制備

1．接種：將已知I型脊髓灰質(zhì)炎病毒分別接種HeLa細(xì)胞3～5瓶，病毒液1ml加維持液9ml/瓶。

2．培養(yǎng)：置5% CO₂培養(yǎng)箱中，37℃條件下培養(yǎng)。

3．收獲：一般培養(yǎng)1～3d，細(xì)胞病變達(dá)++++時(shí)收獲細(xì)胞培養(yǎng)液。

4．離心：將收獲的病毒液經(jīng)2000r/min 15min離心沉淀，去除細(xì)胞碎屑，混勻。

5．分裝：將混勻病毒分裝成1ml管，同時(shí)作無菌試驗(yàn)，證實(shí)無菌后冰凍保存。作病毒滴定用。

（二)病毒滴定

1．稀釋病毒：將I型脊髓灰質(zhì)炎病毒液用維持液連續(xù)作10倍稀釋，由10^-1到10^-10。

2．接種：一般選用10^-4至10^-10的稀釋度接種，每一稀釋度接種4只培養(yǎng)瓶，每瓶0.1ml病毒加0.9ml維持液。同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照管。

3．觀察與計(jì)算：接種后每天或隔天觀察結(jié)果，根據(jù)第7d結(jié)果按Karber公式計(jì)算TCID₅₀(指半數(shù)的細(xì)胞培養(yǎng)瓶出現(xiàn)病變)，即LogTCID₅₀=L-d(S-0.5)

L：指病變最低稀釋度的對(duì)數(shù)。

d：各對(duì)數(shù)稀釋度之間的差數(shù)。

S：病變細(xì)胞瓶比例之總和。

假定每稀釋度接種4瓶，如出現(xiàn)：

第4瓶病變4/4=1　第2瓶病變2/4=0.5

第3瓶病變3/4=0.75第l瓶病變1/4=0.25

病毒稀釋液 病變細(xì)胞瓶比例

10^-1   　　　　　 4/4=1

10^-2   　　　　　 4/4=1

10^-3  　　　　　　4/4=1

10^-4  　　　　　　2/4=0.5

10^-5  　　　　　　1/4=0.25

10^-6  0/4=0

10^-7  LogTCID₅₀=L-d(S-0.5) =-l-1(3.75-0.5)= -4.25

則該病毒LogTCID₅₀的滴度=10^-4.25/0.1ml

（三)中和試驗(yàn)步驟

1．固定病毒：在中和反應(yīng)中，通常用病毒滴度為100 TCID₅₀。Karber公試計(jì)算結(jié)果是指一個(gè)TCID₅₀，如10^4.5即一個(gè)TCID50，如10^2.5為100個(gè)TCID₅₀。例如，病毒滴度為100 TCID₅₀，具體稀釋度為l∶316(查反對(duì)數(shù)表)

2．稀釋血清：先將血清56℃ 30min滅活，然后用Hanks液將血清作不同的稀釋度稀釋1∶10，l∶40，1∶160，1∶640，1∶2560。

3．加病毒：將含100 TCID₅₀的病毒與各稀釋度的血清等量混勻，置37℃，然后分別吸取每個(gè)稀釋度的血清與病毒的混合物0.2ml接種于加有0.8ml維持液的細(xì)胞培養(yǎng)管中，每個(gè)稀釋度種2瓶，同時(shí)做下列對(duì)照：

病毒對(duì)照0.1ml病毒+0.9ml維持液

血清對(duì)照0.1ml(1∶10)血清+0.9ml維持液

細(xì)胞對(duì)照加1ml維持液

4．結(jié)果判定：接種后每天或隔天觀察細(xì)胞病變，第7d判定最后結(jié)果。

一般病毒對(duì)照于第2d出現(xiàn)+～++病變，3～5d達(dá)++++病變，細(xì)胞對(duì)照及血清對(duì)照為陰性(極少數(shù)1：5血清對(duì)細(xì)胞有毒性，但能與特異性病變相區(qū)別)。待測(cè)血清最高稀釋度能抑制50%細(xì)胞病變出現(xiàn)(2瓶中有1瓶未出現(xiàn)病變者)即為該血清中和抗體的效價(jià)(表18-3)。

表18-3 中和試驗(yàn)結(jié)果判斷

血清釋稀倍數(shù)  試驗(yàn)瓶  病毒對(duì)照  細(xì)胞對(duì)照  血清對(duì)照

1:10 －  － +  +  － －  － －

1:40  － －

1:160+  －

1:640+  +

1:2560  +  +

注：－ 無細(xì)胞病變 ＋ 有細(xì)胞病變（＋＋以上)

試驗(yàn)血清中和抗體效價(jià)為1∶160。