形態(tài)學(xué)檢查方法是細(xì)菌檢驗(yàn)中極為重要的鑒定手段之一,它不僅有助于細(xì)菌的初步識(shí)別,同時(shí)也是決定進(jìn)行生化反應(yīng)鑒定的重要步驟。如痰中的抗酸桿菌、腦脊液中腦膜炎球菌、泌尿生殖道分泌物中的淋球菌等。通過形態(tài)學(xué)檢查得到初步的診斷。由于細(xì)菌體積小,無色透明, 因此利用光學(xué)顯微鏡直接檢查只能觀察到細(xì)菌的動(dòng)力,對(duì)形態(tài)、大小、排列方式、染色特性及特殊結(jié)構(gòu)的判定,還須借助于染色標(biāo)本的觀察。要研究其細(xì)菌的超微結(jié)構(gòu),還需用電子顯微鏡。
一、不染色標(biāo)本檢查法
不染色標(biāo)本的檢查用于觀察活菌狀態(tài),常用以檢查細(xì)菌的動(dòng)力或運(yùn)動(dòng)狀況。
1.濕片法:用接種環(huán)取細(xì)菌培養(yǎng)液兩環(huán), 置于載玻片中央,輕輕覆以蓋玻片。菌液要適量,不可外溢,不可有氣泡。高倍鏡下觀察。
2.懸滴法:加一小滴菌液在蓋玻片中央,在另一凹玻片凹窩的周圍涂少量凡士林,將凹面向下,對(duì)準(zhǔn)蓋玻片中央,蓋在凹玻片上,迅速翻轉(zhuǎn)玻片,用小鑷子輕壓,使蓋玻片與zxtf.net.cn凹玻片粘緊,密封凹窩邊緣。高倍鏡下觀察。
3.毛細(xì)管法:本法適用于觀察厭氧菌動(dòng)力。先將待檢菌接種在適宜的液體培養(yǎng)基中,經(jīng)厭氧過夜培養(yǎng)后,以毛細(xì)管(長(zhǎng)60~70nm ,管徑0.5 ~1.0nm ) 接觸培養(yǎng)物,使菌液進(jìn)入毛細(xì)管中,用火焰封閉毛細(xì)管兩端,將毛細(xì)管固定在載玻片上,鏡檢。
二、染色標(biāo)本檢查法
(一) 基本方法
細(xì)菌胞漿無色透明,不易識(shí)別。常用適宜的染料使細(xì)菌著色后,以觀察其形態(tài)和特殊構(gòu)造,且可按染色反應(yīng)進(jìn)行分類。
1.原理
(1) 物理吸附作用:由于毛細(xì)管現(xiàn)象和滲透作用, 使染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)被溶解吸收。此外,細(xì)菌等電點(diǎn)較低,pH值2 ~5,在一般情況下細(xì)菌帶負(fù)電荷,易和帶正電荷的堿性染料相結(jié)合。
(2) 化學(xué)反應(yīng):菌體內(nèi)某些化合物和染料相結(jié)合,發(fā)生化學(xué)反應(yīng)使細(xì)菌著色,而且不易被脫色劑所脫色。
(3) 其他因素:細(xì)胞膜的通透性、膜孔的大小、細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整與否以及培養(yǎng)基成分,染色液中電解質(zhì)含量、pH值、菌齡等都是影響細(xì)菌著色的因素。
2.方法
(1) 涂片:臨床標(biāo)本大多可直接涂抹在潔凈的載玻片上。若是細(xì)菌的液體培養(yǎng)物,可直接加一小滴在載玻片,稍加涂布。若是從固體培養(yǎng)基上取細(xì)菌菌落,則應(yīng)先用接種環(huán)取一環(huán)生理鹽水置于玻片上,然后從培養(yǎng)基上取少許菌在鹽水中輕輕磨勻,使呈輕微乳白渾濁,再涂布擴(kuò)大至直徑20 mm 大小的圓形,待自然干燥,也可加微熱使其干燥。
(2) 固定:涂片干燥后,在火焰上迅速通過3 次加以固定。固定過程可殺死細(xì)菌,凝固細(xì)胞質(zhì)和其他細(xì)胞結(jié)構(gòu),增加細(xì)菌細(xì)胞對(duì)染液的通透性,還可使細(xì)菌涂膜牢固,不被在染色過程中的流水沖洗脫落。
(3) 染色:一般用低濃度染色液(1%以下),滴加染液覆蓋涂膜。分單染法和復(fù)染法。為促使染料與菌體結(jié)合,有的染色法可在染液中加入酚、明礬,有的在染色過程中加碘液,可起到媒染的作用,也有用加熱法促進(jìn)著色的。
(4) 脫色:一般應(yīng)用乙醇、丙酮或酸類作為脫色劑。適當(dāng)掌握脫色時(shí)間以獲良好的效果。脫色劑可以顯示出細(xì)菌與染料結(jié)合的牢固程度,具有鑒別染色的作用。
(5) 復(fù)染:復(fù)染液應(yīng)與初染液的顏色不同,以形成鮮明對(duì)比。復(fù)染可使已脫色的細(xì)菌重新著色。
(二) 常用染色法
1.單染法
即用一種染液染色的方法。
(1) 染液①呂氏亞甲藍(lán)液:以亞甲藍(lán)乙醇飽和溶液(乙醇100 ml 含亞甲藍(lán)2~5g)30 ml 加蒸餾水100 ml 及10%氫氧化鉀0.1 ml 混合即成。②稀釋石炭酸復(fù)紅液:以堿性復(fù)
紅乙醇飽和液(乙醇100 ml 含堿性復(fù)紅3~7g)10 ml 與5%石炭酸液90 ml 混合, 配成石炭酸復(fù)紅染液。再將此染液以蒸餾水作10 倍稀釋即成。
(2) 方法:在已固定的細(xì)菌涂片上滴加呂氏美藍(lán)液或稀釋石炭酸復(fù)紅,染1 分鐘,水洗,干后鏡檢。
(3) 結(jié)果:以呂氏亞甲藍(lán)染色, 菌體呈藍(lán)色。以稀釋石炭酸復(fù)紅染色,菌體呈紅色。
2.革蘭染色法
為最常用的細(xì)菌復(fù)染法。
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1) 染液:第一液:取結(jié)晶紫乙醇飽和液(乙醇100 ml 含結(jié)晶紫7 ~14g)20 ml 與醫(yī)學(xué)全在,線1 %草酸銨水溶液80 ml 混合過濾即成。第二液:碘1g ,碘化鉀2g ,加少量蒸餾水,充分振搖,溶解后加水至300 ml 。第三液:95 % 乙醇或用乙醇、丙酮(7 ∶3) 混合液。第四液:稀釋石炭酸復(fù)紅液(同單染法) 或沙黃溶液(2.5 %沙黃乙醇液10 ml 加水90 ml)。
(2) 方法:將第一液滴加在已固定的細(xì)菌涂片上,染1 分鐘,水洗。再以第二液媒染1 分鐘,水洗。繼以第三液脫色。輕搖玻片,到無紫色脫落為止,水洗。最后以第四液復(fù)染0.5 分鐘,水洗,干后鏡檢。
(3) 結(jié)果:革蘭陽(yáng)性菌呈紫色,革蘭陰性菌呈紅色。
3.抗酸染色法
(1) 染液:①石炭酸復(fù)紅染液:同單染法,但不需用蒸餾水稀釋。②脫色劑:為鹽酸乙醇。③復(fù)染液(呂氏亞甲藍(lán)液) 同單染法。
(2) 方法:在涂片上滴加石炭酸復(fù)紅染液,玻片遠(yuǎn)離火焰使微微加熱而有蒸汽,染液因蒸發(fā)而減少,需隨時(shí)補(bǔ)加染液,防止干涸。如此維持5 分鐘。待冷后,水洗。滴加脫色劑,輕搖玻片,到無紅色流出為止,脫色時(shí)間約1 分鐘。水洗。再滴加復(fù)染液復(fù)染0.5 分鐘,水洗。干后鏡檢。
(3) 結(jié)果:抗酸菌呈紅色,背景及其他細(xì)菌呈藍(lán)色。
4.金胺染色法
(1) 染液:① 金胺“O ” 染液: 金胺“O ”0.1g 溶于95 % 乙醇10 ml,另取石酸3 ml 加水87 ml 中。將上述兩液混勻(若有渾濁,不必過濾),裝人褐色瓶中,保存在室溫中。②0.5 %鹽酸乙醇。③0.5 %高錳酸鉀液。
(2) 方法:在細(xì)菌涂片上加金胺“O” 染液,染15 分鐘,水洗后用0.5 %鹽配乙醇脫色2 分鐘,水洗,再加0.5 %高錳酸鉀液作用3 分鐘,水洗, 待干,用熒光顯微鏡觀察。
(3) 結(jié)果:抗酸菌呈亮黃色熒光。
5.阿爾培(Albert) 異染顆粒染色法
(1) 染液:第一液: 甲苯胺藍(lán)0.15g , 孔雀綠0.2g 溶于95 % 乙醇2 ml 中, 加水100 ml 及冰乙酸1 ml ,靜置24 小時(shí),濾紙過濾。第二液:碘化鉀3g 溶于蒸餾水10 ml ,加
碘2g ,溶解后再加水至300 ml 。
(2) 方法:在涂片上加第一液染色3 ~5 分鐘,水洗后第二液染色1 分鐘,水洗,待干后鏡檢。
(3) 結(jié)果:異染顆粒呈藍(lán)黑色,菌體呈綠色。
6.奈瑟(Neisser) 異染顆粒染色法
(1) 染液:第一液:亞甲藍(lán)100 mg 溶于無水乙醇2 ml 中,加入5 %冰乙酸98 ml ,充分混合,過濾。第二液:俾斯麥褐1g 溶于無水乙醇10 ml 后,加水至100 ml ,充分混合。過濾。
(2) 方法:在細(xì)菌涂片上滴加第一液,染色30 秒至1 分鐘,水洗后,再以第二液染色30 秒至1 分鐘,水洗,干后鏡檢。
(3) 結(jié)果:白喉桿菌菌體染成淡黃褐色,異染顆粒呈深藍(lán)色。
7.黑氏(Hiss) 莢膜染色法
(1) 染液:①結(jié)晶紫染色液:結(jié)晶紫乙醇飽和液5ml 加水95ml 。②20 %硫酸銅水溶液。
(2) 方法:細(xì)菌涂片自然干燥后用乙醇固定。滴加結(jié)晶紫染液,加溫染1 分鐘,不
用水洗,用20 %硫酸銅溶液中沖洗后,以吸水紙吸干鏡檢。
(3) 結(jié)果:菌體呈紫色,莢膜為淡紫色或無色。
8.奧爾特(Olt) 莢膜染色法
(1) 染液:30 %沙黃水溶液(乳缽研磨溶化)。
(2) 方法:在細(xì)菌涂片上滴加染液,用火焰加溫染色3 分鐘,冷后水洗, 待干后鏡檢。
(3) 結(jié)果:菌體呈褐色,莢膜呈黃色。此法主要用于炭疽桿菌的莢膜染色。
9.芽胞染色法
(1) 稀釋石炭酸復(fù)紅液(同單染法),95 %乙醇,堿性亞甲藍(lán)液(同單染法)。
(2) 方法:滴加石炭酸復(fù)紅液, 加溫染5 分鐘,水洗后用乙醇脫色2 分鐘,水洗,滴加亞甲藍(lán)液染1 分鐘,水洗,待干鏡檢。
(3) 結(jié)果:菌體呈藍(lán)色,芽胞呈紅色。
10.魏—張鞭毛染色法
(1) 染液:飽和鉀明礬液5 ml ,5 %石炭酸液5 ml ,20 %鞣酸液2 ml ,三者相互混合。臨用時(shí)加堿性復(fù)紅乙醇飽和液1 ml ,混合后靜止過夜,次日過濾后使用。此染液以
3 天內(nèi)使用效果最佳。
(2) 方法:①先將細(xì)菌在肉湯培養(yǎng)基中傳代6 ~7 次。② 取出斜面培養(yǎng)基管內(nèi)的凝結(jié)水,換以無菌生理鹽水2 ml 。③取細(xì)菌的肉湯培養(yǎng)物一環(huán),接種在斜面瓊脂與護(hù)士招聘網(wǎng)鹽水交界處,再自該部向上劃一直線。④ 在35 ℃ 培育7 ~16 小時(shí), 若為變形桿菌, 則放在22 ℃~25 ℃下培育16 小時(shí)。⑤以接種環(huán)自交界處取出一環(huán)菌液,輕放在加有3 ~4 ml 水的小碟表面,使細(xì)菌自由分散,浮在表面,靜置在溫箱內(nèi)4 ~5 分鐘。⑥ 用接種環(huán)自液面取一環(huán)菌液,放在高度潔凈無油的載玻片上, 切勿研磨和搖動(dòng)。置37 ℃溫箱內(nèi)讓其自干,不能以火焰固定。⑦滴加染液染色0.5 至1 分鐘,水洗,待干鏡檢。
(3) 結(jié)果:菌體鞭毛均呈紅色。
(4) 注意事項(xiàng):①鞭毛染色的細(xì)菌需新鮮的培養(yǎng)物。②涂片的制作不可用接種環(huán)轉(zhuǎn)動(dòng)涂抹,應(yīng)將細(xì)菌輕輕加在玻片上,防止鞭毛脫落。③載玻片要求高度潔凈。
11.負(fù)染色法
本法使背景著色而菌體不著色。用以觀察細(xì)菌及某種真菌的莢膜。
(1) 墨汁染色:用接種環(huán)取一環(huán)菌液(108 ~1010/ml) 放在潔凈載玻片上, 然后在相距2 ~3 m m 處放已稀釋2 ~3 倍的繪圖用墨汁—接種環(huán)。覆蓋蓋玻片后鏡檢。也可將墨汁1 滴與待檢標(biāo)本1 滴混合于載玻片上的一端, 以作血膜推片的方法制片, 干后鏡檢?梢姳尘俺珊诤稚w無色。
(2) 剛果紅染色:在載玻片上置2 %剛果紅水溶液1 小滴, 以極少量的培養(yǎng)菌與其混合,涂成均勻厚片,待干,以1 %鹽酸乙醇洗滌,待自然干燥后鏡檢?梢姳尘盀樗{(lán)色,菌體無色。