三、顯色液
免疫細(xì)胞化學(xué)中，由于抗原-抗體反應(yīng)所形成的復(fù)合物本身無色，無法直接觀察，因而需借助于某些化學(xué)基團(tuán)的呈色作用，使其得以顯示，以利于在顯微鏡下觀察。常用的顯色液有：
1．DAB（Diaminobenzidine)顯色液
DAB即3，3-二氨基苯聯(lián)胺
試劑：DAB（常用四鹽酸鹽) 50mg
0.05mol/L TB 100ml
30% H2O2 30～40μl
配制方法：先以少量0.05mol/L(pH7.6)的TB溶解DAB，然后加入余量TB，充分搖勻，使DAB終濃度為0.05%,過濾后顯色前加入30%的H2O230～40μl，使其終濃度為0.01%。
DAB顯色液主要用于免疫過氧化物酶法（如酶標(biāo)法、PAP法等)，其終產(chǎn)物可直接在光鏡下觀察，也可經(jīng)OsO4處理后，增加反應(yīng)產(chǎn)物的電子密度，用于電鏡觀察。但有幾點(diǎn)需注意：DAB溶解要完全，否則未溶解的顆粒沉積于標(biāo)本上影響觀察；DAB濃度不易過高，否則顯色液呈棕色，增加背景染色，另外DAB有致癌作用，故操作時應(yīng)戴手套，盡量避免與皮膚接觸，用后及時徹底沖洗，接觸DAB的實(shí)驗(yàn)用品最好經(jīng)洗液浸泡24h后使用。
2．4-氯-1-萘酚（4-Cl-1-Naphthol)顯色液
配方1：4-Cl-1-萘酚 100mg
純乙醇 10ml
0.05mol/L TB(pH7.6) 190ml
30% H2O2 10μl(0.003%)
配制方法：先將4-Cl-1-萘酚溶解于乙醇中，然后加入Tb 19ml，用前加入30% H2O2使其終濃度為0.005%，切片顯色時間通常為5～20min。
配方2：4-Cl-1-萘酚
N-二甲基甲酰胺（DMF)
0.05mol/L TB(pH7.6)
30% H2O2
配制方法：先將4-Cl-1-萘酚加入DMF中，加熱溶解使呈乳白色，再加入TB，乳白色變?yōu)樾鯛睿?.5℃加熱5min后加入H2O2，攪動使絮狀消失，趁熱過濾，當(dāng)降至略低于50℃時才放入組織標(biāo)本（注意：溫度過高易損傷標(biāo)本，過低則易重新出現(xiàn)沉淀)。顯色時間通常為5min左右。
4-Cl-1-萘酚的終產(chǎn)物顯示藍(lán)色。
多數(shù)認(rèn)為最好去除白色沉淀（如上述)，但Larsson等認(rèn)為，白色沉淀可作為背景，使陽性部位更易觀察。由于酒精可溶解4-Cl-1-萘酚顯色的組織標(biāo)本，勿用酒精脫水。
3．3-氨基-9-乙基卡唑（3-amino-9-ethylcarbozole,AEC)顯色液
試劑：AEC 20mg
二甲基甲酰胺（DMF) 2.5ml
0.05mol/L醋酸緩沖液（pH5.5) 50ml
30%H2O2 25ml
配制方法：先將AEC溶于DMF中，再加入醋酸緩沖液充分混勻。臨顯色前，加入30%H2O2。切片顯色時間為5～20min。
該顯色液作用后，陽性部分呈深紅色，加以蘇木精或亮綠等作為背景染色，則效果更佳。由于終產(chǎn)物溶于酒精和水，故需用甘油封固。
4．TMB顯色液
試劑：TMB
HCl
亞硝基鐵氰化鉀
無水酒精
配制方法：
（1)醋酸鹽緩沖液：取1.0mol/L的HCl 190ml加入1.0mol/L的醋酸鈉400ml中混合，再加蒸餾水稀釋至1000ml，用醋酸或NaOH將pH調(diào)至3.3。
�。�2)A液：取上述緩沖液5ml，溶解100mg亞硝基鐵氰化鉀，加蒸餾水92.5ml混合。
�。�3)B液：稱取5mg TMB加入2.5ml無水酒精中，可加熱至37℃～40℃直到TMB完全溶解。
�。�4)孵育液：放入標(biāo)本前數(shù)秒，取2.5ml B液及97.5ml A溶于試管中充分混合。（液體在20min內(nèi)應(yīng)保持清亮的黃綠色，否則可能已有污染)。酶反應(yīng)時，加入終濃度為0.005%的H2O2。
（5)主要顯色步驟：組織標(biāo)本在蒸餾水（或PBS)中漂洗數(shù)次（每次約10～15min)后放入未加H2O2的孵育液中作用20min（19℃～30℃)，然后向孵育液中放入H2O2（每100ml孵育液中加0.3%的H2O2 1.0～5.0ml)繼續(xù)孵育液20min左右（19℃～23℃)，撈出標(biāo)本漂洗數(shù)次（共30min左右)。在0～4℃條件下可在漂洗液放置4h直至貼片、脫水，封片。也可在貼片前在1%的中性紅中負(fù)染2～3min，也可在1%派諾寧（pH3.3～3.5)中負(fù)染5min后貼片、脫水、封片。醫(yī)學(xué)全在線www.med126.com
TMB即四甲基聯(lián)苯胺（Tetrabenzidine)是一種脂溶性較強(qiáng)的基團(tuán)，因此容易進(jìn)入細(xì)胞與細(xì)胞器中的HRP反應(yīng)，且由于這種高度的脂溶性，使其易形成多聚體，在HRP活性部位產(chǎn)生粗大的、深蘭色沉淀物，這使得TMB成為組化實(shí)驗(yàn)中的一種很好的發(fā)色團(tuán)。同時反應(yīng)產(chǎn)物的沉淀，使得HRP的活性部位更加暴露，利于酶氧化反應(yīng)進(jìn)行。TMB的反應(yīng)產(chǎn)物為深藍(lán)色，利于光鏡觀察，且反應(yīng)產(chǎn)物越聚越大，常超出單個細(xì)胞器的范圍（而DAB則被限制在其內(nèi))，故TMB反應(yīng)的檢測閾較低。由于上述優(yōu)點(diǎn)，目前TMB常用于光鏡及超微結(jié)構(gòu)水平的HRP及HRP-WGA神經(jīng)投射的研究。需要注意的是：TMB顯色液中的A液和B液應(yīng)在2h內(nèi)新鮮配制。另外，TMB是一種較強(qiáng)的皮膚刺激劑，并有致癌的潛在可能，故使用時應(yīng)帶手套及在通風(fēng)條件下操作。
5．NBT顯色液
試劑A液：5%NBT：稱 取0.5gNBT溶于10ml 70%的DMF（二甲基甲胺)內(nèi)，充分混合，常存于4℃，也可裝成小份，-20℃保存，用前復(fù)溫。
B液：5% BCIP：稱取BCIp 0.5g溶于10ml 100%的DMF內(nèi)，混勻。4℃或分裝存于-20℃，用前恢復(fù)至室溫。
C．顯色液：取A液40μl，加入到盛有10ml的0.1mol/l Tris-HCl(pH9.5,鈐0.1mol/L NaCl、5mmol/L MgCl2)管內(nèi)，充分混勻；再加入B液40μl，輕輕混合即可。最好用前新鮮配制。
NBT即四唑氮藍(lán)（Nitro-Blue-Tetrazolium),MW=818,為深藍(lán)色無定形微溶物質(zhì)。BCIP即5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate)。當(dāng)二者存在時，在堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase, AP)作用下，NBT被還原形成顯微鏡下可見的藍(lán)色或紫色沉淀。
