五、研究神經(jīng)遞質(zhì)的超微結(jié)構(gòu)定位
應(yīng)用免疫電子顯微鏡技術(shù)（常用為PAP法或膠體金標(biāo)記技術(shù))可顯示抗原在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)定位及在突觸水平神經(jīng)元間的聯(lián)系的化學(xué)本質(zhì)。Pickel應(yīng)用免疫電鏡觀察證明TH存在于DA和DA能神經(jīng)元的細(xì)胞體、樹突和近側(cè)軸突。在胞體內(nèi)此酶定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、Golgi器和微管上。神經(jīng)終末枝的突觸小泡一般認(rèn)為是神經(jīng)遞質(zhì)的亞細(xì)胞貯存部位，在電鏡下觀察神經(jīng)末梢內(nèi)突觸小泡呈現(xiàn)不同形態(tài)，目前已有文獻(xiàn)報(bào)道的近10余種，比較常見(jiàn)的為無(wú)顆粒小泡型（Small agranular vesicles , SAV)或稱清亮小泡型（Small Clear Vesicles, SCV)，其直徑50～90nm，中心無(wú)顆粒（圖11-1E)；該型�；煊胁煌壤旅芎诵牡拇竽遗荩睆�80～150nm。其次是顆粒小囊泡型（Small granular vesicles, SGV)，直徑45～70nm，內(nèi)含有電子密度高的致密核心（圖11-1A)。第三是大顆粒泡型（large granular vesicles, LGV)，直徑80～160nm的突觸小泡內(nèi)含有電子密度高的致密核心（圖11-1B)。其它還有扁平囊泡型、線粒體型等（圖11-1)。是否不同形態(tài)的突觸小泡代表了含有不同種類的神經(jīng)遞質(zhì)尚有爭(zhēng)論。有學(xué)者認(rèn)為不同形態(tài)的突觸小泡只是使用不同種類固定液的人工假象，然而越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證明表明，固定液的種類固然有一定影響，但神經(jīng)終末突觸小泡的形態(tài)和內(nèi)含遞質(zhì)的種類似乎存在一定的相關(guān)性，SAV型是取得比較一致意見(jiàn)的神經(jīng)終末類型，它和骨骼肌運(yùn)動(dòng)終板（也是神經(jīng)—肌肉的突觸)內(nèi)所含突觸小泡的形態(tài)相一致，后者已證明為乙酰膽堿神經(jīng)遞質(zhì)的貯存處，細(xì)胞化學(xué)示Ach陽(yáng)性反應(yīng)，電刺激時(shí)突觸小泡減少，示釋放現(xiàn)象。這種類型的突觸小泡內(nèi)可能含有乙酰膽堿。
圖11-1 神經(jīng)末梢突觸中囊泡類型
SGV型一般認(rèn)為是單胺介質(zhì)的貯存部位，單胺類介質(zhì)。包括兒茶酚胺和吲胺二種，屬于前者的介質(zhì)有去甲腎上腺素、多巴胺、腎上腺素、屬于后者的介質(zhì)為5—HT。在常規(guī)電鏡生物樣品處理的過(guò)程中，小顆粒囊泡不易顯示，須應(yīng)用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0)配制的3%高錳酸鉀溶液（Richardson1966)或鉻酸鹽/重鉻酸鹽溶液（Tranzer 1976)固定，方能獲得滿意結(jié)果。認(rèn)為SGV是單胺遞質(zhì)貯存部位的根據(jù)是：用利血平注射能使小泡內(nèi)致密核心消失，而用偽介質(zhì)（Pseudo—neurotransmitter )如5-羥多巴胺（5—OHDA )注射動(dòng)物，由于偽介質(zhì)能置換內(nèi)源性單胺而被吸收和貯存于突觸囊泡中，末梢中小顆粒囊泡的數(shù)目增加，電刺激交感神經(jīng)可使小顆粒囊泡減少，而將α甲基去甲腎上腺素給予被擬交感神經(jīng)藥物或被電刺激耗竭了介質(zhì)的動(dòng)物，其神經(jīng)末梢中的小顆粒囊泡又可重新出現(xiàn)。但1982年Wilson等應(yīng)用多種實(shí)驗(yàn)證明，至少在小腸肌間神經(jīng)叢內(nèi)，腎上腺素能神經(jīng)的終末支是扁平無(wú)顆粒囊泡型（flat agranular vesicles, FAV)，而不是SGV型。1965年Taxi在兩棲類動(dòng)物的腸道中發(fā)現(xiàn)含大顆粒囊泡的神經(jīng)終末支LGV，Baumgarten(1970)在哺乳動(dòng)物腸道也發(fā)現(xiàn)了LGV型神經(jīng)終末支，因其形態(tài)與丘腦下部含肽的神經(jīng)末支相似，故命名為P型神經(jīng)終末支，意即肽能神經(jīng)（Peptidergic nerves)終末支，而有作者認(rèn)為凡是顆粒囊泡，包括SGV和LGV都是單胺類遞質(zhì)的貯存部位。免疫電鏡技術(shù)部分地解決了這一爭(zhēng)論。應(yīng)用PAP和膠體金免疫電鏡技術(shù)證明VIP、SP、降鈣基團(tuán)相關(guān)肽（CGRP)和神經(jīng)肽Y（NPY)等多肽類物質(zhì)確實(shí)定位于大顆粒囊泡中（Larsson 1976, Bishop 1982, Probert et al, 1983)。有作者還認(rèn)為不同種類的多肽分別被包含于不同直徑的大顆粒囊泡中，如SP定位于直徑85nm的大顆粒囊泡中；VIP：囊泡直徑98nm；ENK：囊泡直徑110nm等，但不同作者在不同動(dòng)物種屬和不同組織、應(yīng)用方法不同報(bào)告結(jié)果各異，難以結(jié)論。Fried（1985)應(yīng)用免疫組化、電鏡技術(shù)和密度梯度離心法相結(jié)合，證明在大鼠輸精管神經(jīng)終末支小顆粒囊泡中含有NA，而大顆粒囊泡分為三種類型：?jiǎn)渭兒琋PY或NA，或NA與NPY共存于一個(gè)囊泡中。Burnstock還提出直徑100～200nm的大的不透明囊泡（LOV型)系嘌呤能神經(jīng)遞質(zhì)的貯存部位（圖11-1，G)，神經(jīng)終末支內(nèi)全為線粒體所充滿的可能屬感覺(jué)神經(jīng)終末支（圖11-1，H)。凡此種種，都說(shuō)明雖然免疫電鏡提供了神經(jīng)遞質(zhì)超微結(jié)構(gòu)水平定位定性的可能，但神經(jīng)終末內(nèi)突觸小泡的形態(tài)與神經(jīng)遞質(zhì)種類之間的關(guān)系始終還有待于進(jìn)一步的研究。如SAV型在外周可能是代表膽堿能神經(jīng)的終末支，在中樞能否說(shuō)SAV內(nèi)所含的都是乙酰膽堿，其它各型的突觸小泡內(nèi)所含神經(jīng)遞質(zhì)的種類也還需要進(jìn)一步研究。在技術(shù)方法上的運(yùn)用，根據(jù)筆者體會(huì)，應(yīng)用免疫電鏡PAP法，免疫反應(yīng)復(fù)合物相當(dāng)大，有時(shí)很難準(zhǔn)確地判斷免疫反應(yīng)復(fù)合物的定位，因在囊泡基質(zhì)內(nèi)和囊泡膜上雹有反應(yīng)物附著，免疫膠體金電鏡技術(shù)避免了上述缺點(diǎn)，膠體金顆粒的沉積比較集中于囊泡基質(zhì)內(nèi)，在遞質(zhì)超微結(jié)構(gòu)定位的研究上似較PAP法優(yōu)越。
六、神經(jīng)遞質(zhì)共存的研究
免疫細(xì)胞化學(xué)在神經(jīng)科學(xué)的運(yùn)用打破了傳統(tǒng)的一個(gè)神經(jīng)細(xì)胞只產(chǎn)生和釋放一種神經(jīng)遞質(zhì)的概念。在中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)，近年來(lái)，有較多的實(shí)驗(yàn)報(bào)告證明在一個(gè)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)存在兩種或兩種以上的遞質(zhì)，這種遞質(zhì)共存不是偶然和個(gè)別的現(xiàn)象，而是一種帶普遍規(guī)律的問(wèn)題。在光鏡水平顯示神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)兩種抗原的共存，其分辨率只限于胞體，觀察神經(jīng)纖維內(nèi)兩種抗原的共存，必須借助免疫電鏡技術(shù)。共存情況可出現(xiàn)于：（1)經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)間，如在大鼠頸上交感神經(jīng)節(jié) 的相鄰照片上，同一神經(jīng)細(xì)胞分別顯示NA和ACh陽(yáng)性；（2)經(jīng)典遞質(zhì)與單胺類遞質(zhì)間，如在松果體交感神經(jīng)末梢中，不僅含有NA，而且含有5—HT；（3)經(jīng)典遞質(zhì)和神經(jīng)肽間，如在大鼠的椎前神經(jīng)節(jié) 中，大約有60%的NA能神經(jīng)細(xì)胞同時(shí)顯示SOM免疫反應(yīng)陽(yáng)性，說(shuō)明SOM與NA的共存，在交感神經(jīng)系統(tǒng)中NPY與NA的共存，在副交感神經(jīng)系統(tǒng)中VIP與ACh的共存，已得到較為普遍的證實(shí)；（4)單胺類遞質(zhì)與神經(jīng)肽的共存，如大鼠輸精管的交感神經(jīng)終末支中NA與NPY的共存，在豚鼠腸道肌間神經(jīng)節(jié) 中5—HT與SP免疫反應(yīng)物共存一個(gè)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，和（5)神經(jīng)肽間的共存，如SP與CGRP常共存于感覺(jué)神經(jīng)終末支，Gibbins等（1987)在豚鼠背根神經(jīng)節(jié) 細(xì)胞中證明SP、CGRP、CCK和強(qiáng)啡肽（Dynorphin，DYN)四種神經(jīng)肽的共存。對(duì)于神經(jīng)遞質(zhì)共存的亞細(xì)胞部位，Hokfelt曾對(duì)肽和胺的共存提出了一種假說(shuō)，即：①它們可分別貯存于同一神經(jīng)終末內(nèi)的不同形態(tài)的突觸小泡內(nèi)；②共存于大顆粒囊泡和小顆粒囊泡內(nèi)；③僅共存于小顆粒囊泡中；④僅共存于大顆粒囊泡內(nèi)；此假說(shuō)尚待進(jìn)一步證實(shí)。Fried 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在大鼠輸精管，胺和肽的共存僅發(fā)生于大顆粒囊泡內(nèi)，Andrzejloesch 和Burnstock實(shí)驗(yàn)證明在豚鼠腸道肌間神經(jīng)叢內(nèi)VIP和ACh共存于SAV小囊泡內(nèi)。應(yīng)用膠體金免疫電鏡技術(shù)，以不同直徑的金粒標(biāo)記不同的抗原，是研究遞質(zhì)共存的超微結(jié)構(gòu)定位較為理想的手段。
關(guān)于遞質(zhì)共存的生理意義，目前還不十分清楚，有作者設(shè)想與經(jīng)典遞質(zhì)共存的肽類可作為輔遞質(zhì)，在神經(jīng)細(xì)胞釋放時(shí)，對(duì)突觸后膜上主遞質(zhì)的受體起調(diào)制作用，從而調(diào)制信息傳遞。Hokfelt（1980)提出兩種遞質(zhì)共存的生理意義有以下五種可能性：①兩種遞質(zhì)可穿過(guò)突觸間隙作用于突觸后細(xì)胞，作用于相同或不同的受體；②一種物質(zhì)激活突觸后細(xì)胞的受體，另一種物質(zhì)則封閉另一種類型的受體，如在5—HT和SP共存的情況下，5—HT直接抑制突觸后細(xì)胞，SP封閉其它末梢釋放的ACh對(duì)突觸后的細(xì)胞的興奮作用；③一種物質(zhì)作用于突觸后細(xì)胞，第二種物質(zhì)則作用于突觸前末梢的自身受體（autoreceptor)，從而調(diào)制細(xì)胞終末對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放；④一種物質(zhì)作用于突觸后細(xì)胞，第二種物質(zhì)則作用于其它末梢上的突觸前受體；⑤一種物質(zhì)作用于一類細(xì)胞，另一種物質(zhì)作用于另一種細(xì)胞，在這方面典型的例子是汗腺，汗腺的交感神經(jīng)元內(nèi)含有VIP和ACh，前者作用于周圍小血管，增加血流量；后者作用于腺體，刺激汗腺分泌。
總之，遞質(zhì)共存的研究是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域中一個(gè)嶄新的課題，它的研究對(duì)進(jìn)一步了解復(fù)雜的神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能有重要意義，而在這項(xiàng)課題的研究中，免疫細(xì)胞化學(xué)（包括光鏡和電鏡)無(wú)疑是一項(xiàng)有力的工具。
