本品系用各地區(qū)主要的鉤端螺旋體流行菌型，經(jīng)培育、殺菌后，按型別配成單價(jià)或多價(jià)菌苗，用于預(yù)防鉤映螺旋體病。
1 菌種
1.1 菌種來源
制造菌苗用之菌種，由中國藥品生物制品檢定所分發(fā)或經(jīng)同意。疫情需要時(shí)，新分離的菌種經(jīng)與質(zhì)量檢定部門會(huì)同檢定符合規(guī)程要求，并經(jīng)中國藥品生物制品檢定所同意后方可用于生產(chǎn)。
1.2 菌種檢定。
生產(chǎn)用的菌種應(yīng)通過體重120～220g的豚鼠傳代，2～3天后或?yàn)l死前抽取心血或摘取肝組織，接種生產(chǎn)用養(yǎng)基或其他適宜的培養(yǎng)基，并培育傳至4代以上即可進(jìn)行各項(xiàng)檢定。
1.2.1 培養(yǎng)特性
將上述菌種擱于生產(chǎn)培養(yǎng)基，接種量在5%以下，28～32℃培育5～10天，鉤端螺旋體菌數(shù)應(yīng)達(dá)每視野100條/400x以上。培養(yǎng)物應(yīng)透明，微帶乳光，搖動(dòng)時(shí)稍有云霧狀混濁，菌形要求整齊，運(yùn)動(dòng)活潑，兩端形成鉤狀。
1.2.2 血清凝集反應(yīng)
用3～10天的活培養(yǎng)物，每視野50～100條/400x，運(yùn)動(dòng)良好，且無自凝的鉤端螺旋體，與特異性血清做定量凝集反應(yīng)，其凝集效價(jià)應(yīng)達(dá)血清原效價(jià)之半。終點(diǎn)效價(jià)以菌數(shù)減少50%（++)為判定標(biāo)準(zhǔn)。新菌種要求用凝集素交叉吸收試驗(yàn)法定型。
1.2.3 毒力試驗(yàn)
用體重180～220g的健康豚鼠6只，分成兩組，弱毒、強(qiáng)毒株分別各皮下注射培育5～10天，每視野50～100條/400x活培養(yǎng)物2ml。弱毒株注射后48小時(shí)抽取心血，按1%量接種于生產(chǎn)培養(yǎng)基或其他適宜培養(yǎng)基2支，培育14天，鏡檢。要求培育全部陽性，判為合格。強(qiáng)毒株注射后，觀察10天，至少應(yīng)有2只豚鼠因患鉤端螺旋體病死亡，判為合格。
1.2.4 免疫力試驗(yàn)
用培育5～10天每視野70～100條/400x經(jīng)56～58℃加溫1小時(shí)或0.3%(ml/ml)苯酚殺死的鉤端螺旋體培養(yǎng)物，以生理鹽水做3倍稀釋，免疫體重120～220g健康豚鼠3只（對(duì)照組3只應(yīng)同時(shí)飼養(yǎng))，皮下免疫2次，第1次0.5ml，第2次1ml，間隔5天，末次注射后10～12天用同株或同型異株培育5～10天每視野50～100條/400x的培養(yǎng)物2ml進(jìn)行皮下攻擊。
強(qiáng)毒株：攻擊后觀察10天，免疫組豚鼠應(yīng)健存，外觀及食欲正常，不聳毛，運(yùn)動(dòng)活潑，體重增加，解剖無黃疸。對(duì)照組豚鼠至少應(yīng)有2只患鉤端螺旋體病死亡，判為合格。
弱毒株：攻擊后，24小時(shí)抽取心血，接種2管5%～8%兔血清培養(yǎng)基，每管1～2滴（約為1%接種量)。培育14天。免疫組心血培養(yǎng)要求2/3以上為陰性，對(duì)照組均為陽性，判為合格。
1.2.5 抗原性試驗(yàn)
用培育5～10天每視野70～100條/400x經(jīng)56℃加溫1小時(shí)殺死的培養(yǎng)物，靜脈免疫體重2.0～2.5kg的健康家兔3只，各按1ml、2ml與5ml，共注射3次，間隔5天，末次注射10～15天取家兔血清與同株培養(yǎng)物作凝集反應(yīng)，至少應(yīng)有2只家兔血清效價(jià)達(dá)到1∶10000以上判為合格。
1.3 菌各保存
1.3.1 鉤端螺旋體菌種應(yīng)保存于含兔血清培養(yǎng)基或其他適宜培養(yǎng)基內(nèi)，存放在18～22℃暗處，定期傳代保存或液氮保存。
1.3.2 為保存菌種的毒力及純度，每傳3～6代，應(yīng)通過體重120～220g健康豚鼠一次，并同時(shí)做血清學(xué)特性檢查。
2 菌苗制造
制造菌苗用的菌種每型可包括1～3株。
2.1 菌種
用體重120～220g的健康豚鼠，皮下注射培育5～10天生長良好的種子培養(yǎng)物2ml，注射后2～3天或?yàn)l死前抽取心血或摘取肝組織，按1%以下量接種于生產(chǎn)用培養(yǎng)基或其他適宜的培養(yǎng)基，28～32℃培育7～18天，個(gè)別不易生長的菌種可延至30天，經(jīng)檢查為生長良好，運(yùn)動(dòng)活潑的純培養(yǎng)，方可用于大量接種。此外洗種法也可使用。液氮保存菌種復(fù)蘇后即可用于生產(chǎn)。
第1代菌種須做純菌試驗(yàn)及血清學(xué)特性檢查。前5代接種量均不應(yīng)超過10%。
制造菌苗所用之菌種不應(yīng)低于4代（洗種法除外)，最多不超過菌種檢定許可的代數(shù)（從感染動(dòng)物或復(fù)蘇后接種第1代算起)。
2.2 培育
2.2.1 生產(chǎn)用培養(yǎng)基可用綜合或半綜合培養(yǎng)基。用10L大瓶或大罐通氣培養(yǎng)時(shí)，經(jīng)28～32℃培育5～14天，菌數(shù)應(yīng)達(dá)300條/400x以上。取樣作純菌試驗(yàn)及鏡檢，應(yīng)無雜菌。培養(yǎng)物可用適當(dāng)?shù)姆椒饪s。
2.2.2 培養(yǎng)物用苯酚或其他適宜殺菌劑殺菌。苯酚含量為0.25%～0.35%(g/ml)。
2.2.3 加苯酚的菌液于配合后，混勻，至少放置30分鐘，取樣鏡檢菌體滅活情況，測(cè)苯酚含量。
大瓶培養(yǎng)應(yīng)逐瓶做無菌試驗(yàn)。
2.3 菌苗配制
2.3.1 殺菌后，按預(yù)定比例將不同菌型培養(yǎng)物混合成1批。大罐培養(yǎng)亦可先合并后殺菌。若移至大瓶存放，應(yīng)按前、中、后抽樣做無菌試驗(yàn)。菌液如放置放半年以上。合并前應(yīng)逐瓶重做無菌試驗(yàn)。
2.3.2 菌苗所含菌型應(yīng)按當(dāng)?shù)刂饕餍芯团浜希?價(jià)以下（含5價(jià))者，每型含菌數(shù)不低于1.5億條/ml，各型配合比例，不應(yīng)超過或低于計(jì)算量的10%。六價(jià)以上菌苗，每型含菌數(shù)不應(yīng)低于1億條/m.l，但菌苗的總菌數(shù)不應(yīng)超過12.5億條/ml。
2.3.3 菌苗中應(yīng)加氯化鈉，使其最后含量為0.75%～0.9%(g/ml)。
2.4 菌苗分批
同日合并的菌苗作為1批。大罐混合者，每罐作為1批，并按分裝機(jī)分為亞批。
2.5 分裝
分裝后按亞批抽樣，送質(zhì)量檢定部門檢定。
3 成品檢定
3.1 物理化學(xué)檢查
應(yīng)為微帶乳光的液體，不應(yīng)變色，無異臭，無搖不散的凝塊及異物。PH值應(yīng)為6.4～7.4。氯化鈉含量應(yīng)為0.75%～0.9%（g/ml)。苯酚含量不超過0.25%～0.35%zxtf.net.cn/kuaiji/(g/ml)。
3.2 無菌試驗(yàn)
按《生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。
3.3 安全試驗(yàn)
3.3.1 防腐劑試驗(yàn)
用體重18～20g健康小白鼠2只，各皮下注射0.5ml，注射后戰(zhàn)栗不得超過半小時(shí)，觀察7天，應(yīng)活存。局部不得有膿腫或壞死。
3.3.2 毒性試驗(yàn)
用體重18～20g之健康小白鼠5只，每只腹腔注射菌苗0.5ml，或用體重350～450g之健康豚鼠2只，腹腔注射菌苗0.5ml，觀察7日，應(yīng)無死亡。
3.4 免疫力試驗(yàn)
按成品菌苗所含菌型價(jià)數(shù)檢定，用生理鹽水將菌苗稀成每型含菌數(shù)0.5億條/ml。每生產(chǎn)年度生產(chǎn)前3批均勻應(yīng)做免疫力試驗(yàn)，以后每5批至少抽檢1批。試驗(yàn)方法與判定標(biāo)準(zhǔn)同1.2.4項(xiàng)。
3.5 鑒別試驗(yàn)
采用反向間接炭凝集試驗(yàn)，按成品菌苗所含菌型價(jià)數(shù)與相應(yīng)炭血清做炭凝集試驗(yàn)，應(yīng)產(chǎn)生特異性凝集。
4 保存與效期
應(yīng)保存于2～8℃暗處，自殺菌之日起效期為zxtf.net.cn/shiti/1年半。
