本品系采用鼠疫菌弱毒菌株，經(jīng)培育后凍干制成。用于預(yù)防鼠疫。
1 菌種
1.1 菌種來(lái)源
用弱毒的EV菌株，由中國(guó)藥品生物制品檢定所分發(fā)或經(jīng)同意。
1.2 菌種檢zxtf.net.cn/job/定
凍干菌種在生產(chǎn)前每年需要檢查一次培養(yǎng)特性、生化特性、噬菌體裂解試驗(yàn)及安全性。
1.2.1 培養(yǎng)特性
在瓊脂平皿上，37℃培育44～48小時(shí)之菌落應(yīng)為粗糙型，在肉湯中液面有薄菌膜，管底有沉淀物，肉湯透明。
1.2.2 生化特性
應(yīng)分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，石蕊牛乳輕度變紅，在甘油培養(yǎng)基內(nèi)不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。
1.2.3 噬菌體裂解試驗(yàn)
將EV菌種涂于瓊脂平皿上，加滴度為10-6以上的鼠疫噬菌體1滴，于28℃培育44～48小時(shí)，在噬菌體流過(guò)的地方應(yīng)無(wú)本菌生長(zhǎng)。
1.2.4 安全試驗(yàn)
用體重300～400g豚鼠3只，每只皮下注射120億菌（28～30℃培育44～48小時(shí)的培養(yǎng)物)。在注射后第6天解剖1只，第21天解剖2只，檢查注射部位、脾、肝、肺，并用脾、肝、肺及心血進(jìn)行培育。其中心血和肺培育應(yīng)無(wú)本菌生長(zhǎng)。肉眼檢查病變，注射部位可見(jiàn)充血，浸潤(rùn)變?yōu)槟摨儯魏推⒖捎星鹫顮罱Y(jié)節(jié)，肺部不應(yīng)有鼠疫特異病變?yōu)榘踩囼?yàn)合格。肺部如有顯著病變時(shí)，應(yīng)用同量豚鼠復(fù)試，若仍有顯著病變時(shí)，菌種應(yīng)廢棄。
1.2.5 免疫力試驗(yàn)
用體得200～250g的豚鼠10只，每只皮下注射70萬(wàn)菌（28～30℃培育44～48小時(shí)的培養(yǎng)物)一次。于20～25天后進(jìn)行攻擊，每只皮下感染鼠疫強(qiáng)毒菌200個(gè)MLD。。同時(shí)用3組豚鼠作對(duì)照，每組3只，各組豚鼠皮下分別注射0.5、1及2個(gè)MLD的毒菌。免疫組及對(duì)照組至少觀察25天。免疫動(dòng)物存活不少于8只，而對(duì)照動(dòng)物注射1個(gè)及2個(gè)MLD全部死亡時(shí)，免疫力試驗(yàn)為合格。
1.3 菌種保存
菌種應(yīng)凍干保存，凍干菌種保存于2～8℃暗處。
2 菌苗制造
2.1 制造鼠疫活菌苗之實(shí)驗(yàn)室在生產(chǎn)期間應(yīng)專(zhuān)用，不得作其他細(xì)菌工作，絕對(duì)禁止保存鼠疫毒菌。
2.2 制造用培養(yǎng)基
制造菌種可用pH6.8~ 7.2的厚氏瓊脂培養(yǎng)基或其他適宜的培養(yǎng)基。
2.3 原液制造
2.3.1 第1代菌種
啟開(kāi)干燥菌種加入生理鹽水溶解后，接種于厚氏瓊脂培養(yǎng)基上，于28～30℃培育44～48小時(shí)為第1代。放2～8℃保存可使用半個(gè)月。
2.3.2 第2代菌種
用生理鹽水將第1工菌種洗下，接種足夠量的種子瓶，于28～30℃培育44～48小時(shí)為第2代，供大批生產(chǎn)用。不得用第3代菌種生產(chǎn)。
2.3.3 大量接種
第2代菌種經(jīng)肉眼檢查無(wú)雜菌后，加入適量生理鹽水洗下菌苔，制成均勻的菌懸液，用此菌懸液接種培養(yǎng)瓶，于28～30℃培育44～48小時(shí)后，逐瓶肉眼檢查，有雜菌者廢棄。
2.3.4 采集
用由蔗糖、明膠、硫脲、味精及尿素組成的保護(hù)液洗下菌苔（洗菌前將凝固水倒去)或?qū)⒕稳肷鲜霰Ｗo(hù)液內(nèi)，制成原液。每瓶原液均應(yīng)按《生物制品無(wú)菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行純菌試驗(yàn)，不得有雜菌生長(zhǎng)。
2.3.5 合并、稀釋、分裝
用4層紗布或絹布將純菌試驗(yàn)合格之原液過(guò)濾合并，按中國(guó)細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)比濁后用保護(hù)液稀釋?zhuān)瓜♂尯竺咳朔莺鷶?shù)7億～9億。然后按10或20人份分裝于安瓿，并進(jìn)行凍干。采集至凍干，原液不得超過(guò)7天，合并后的原液應(yīng)按《生物制品無(wú)菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行純菌試驗(yàn)。
2.4 菌苗分批
同一日培育的原液于同一次冷凍干燥者為1批。如1批有數(shù)瓶，應(yīng)分亞批。
3 凍干
菌苗分裝后應(yīng)立即在-30℃以下進(jìn)行冷凍。干燥時(shí)間可根據(jù)水含量及活菌數(shù)來(lái)決定。干燥完畢后進(jìn)行真空封口，亦可充氮封口。
4 成品檢定
4.1 物理性狀檢查
本品為白色或淡黃色疏松體。用真空測(cè)定器檢查安瓿應(yīng)為真空。菌苗水分含量不得超過(guò)3%。加入生理鹽水后應(yīng)在半分鐘內(nèi)溶解成均勻懸液。
4.2 濃度測(cè)定
菌苗經(jīng)稀釋后，按中國(guó)細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)（7億/ml)測(cè)定濃度。皮上劃痕用菌苗每人份含菌數(shù)為7億～9億。
4.3 活菌數(shù)測(cè)定
由生產(chǎn)部門(mén)會(huì)同質(zhì)量檢定部門(mén)進(jìn)行。每亞批取3支安瓿，加生理鹽水溶解后，混勻比濁，稀釋至10億/ml。再按10倍系列稀釋至10-6。用10-6稀釋度懸液接種5個(gè)平皿，每個(gè)平皿接種0.1ml。涂勻后放28～30℃培育2～3天，計(jì)算活菌數(shù)。凍干后活菌率不少于45%為合格。如低于45%時(shí)可復(fù)試，如仍不合格則該批菌苗應(yīng)廢棄。
4.4 純菌試驗(yàn)
每批菌苗按《生物制品無(wú)菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。
5 菌落、菌形檢查
應(yīng)呈典型粗糙型菌落，涂片鏡檢，為革蘭氏陰性桿菌。
4.6 安全試驗(yàn)
由生產(chǎn)部門(mén)會(huì)同質(zhì)量檢定部門(mén)進(jìn)行。每亞批菌苗取2支安瓿，用生理鹽水溶解后，用體重300～400g豚鼠2只，每只皮下注射120億菌，第6天稱(chēng)豚鼠體重（不應(yīng)比原體重減輕1/5以上)并取其中1只解剖，另1只觀察到21天解剖。檢查項(xiàng)目及要求均同1.2.4項(xiàng)。
4.7 免疫力試驗(yàn)
每10批菌苗抽檢，10批以下者每3～5年至少檢查1次。由生產(chǎn)部門(mén)會(huì)同質(zhì)量檢定部門(mén)進(jìn)行。用體重250～300g豚鼠10只，每只皮下注射5000萬(wàn)菌，注射后20～25天以200個(gè)MLD的鼠疫毒菌進(jìn)行皮下攻擊。同時(shí)有3組豚鼠作對(duì)照，每組3只，分別于各組豚鼠皮下注射0.5、1和2個(gè)MLD。各組動(dòng)物于注射后，觀察25天。免疫動(dòng)物活存不少于8只，而對(duì)照動(dòng)物注射1個(gè)和2個(gè)MLD全部死亡時(shí)，免疫力試驗(yàn)為合格。
5 保存與效期
應(yīng)保存于2～8℃暗處。自凍干后活菌數(shù)檢定合格之日起效期為1年。
