1 材料
1.1試劑
1.1.10.05mol/L CaCl2溶液
稱7.35gCaCl2·2H2O(分析純),加蒸餾水溶解,稀釋至1000ml。
1.1.20.025mol/L CaCl2溶液
稱3.675gCaCl2·2H2O(分析純),加蒸餾水溶解,稀釋至1000ml。
1.1.3 咪唑緩沖液
稱0.68g咪唑和1.17gNaCl,溶于約100ml蒸餾水中,加37.2ml0.1mol/l HCl,加蒸餾水至200ml,pH為7.3~7.4。
1.1.4 枸櫞酸鹽-氯化鈉溶液
1份3.8%枸櫞酸三鈉溶液加5份0.85%NaCl溶液混勻。
1.1.5Al(OH)3膠
a稱(NH4)2SO45.5g,溶于150ml63℃蒸餾水中。
B稱氨明礬19.175g,溶于250ml58℃的蒸餾水中。
C最取12.5ml氨水(比重0.88),加12.5ml蒸餾水。
三種溶液配畢后,立即將c液迅速倒入a液中攪勻,然后在攪拌下將此混合液迅速倒入b液,用力攪拌10分鐘(保持溫度不低于58℃),離心(25zxtf.net.cn/zhicheng/00r/min,15分鐘),棄上清,沉淀洗滌5次。
第一次:用75ml蒸餾水加0.055ml氨水(比重0.88)混勻,離心,棄上清。
第二次:用75ml蒸餾水加0.11ml氨水(比重0.88)混勻,離心,棄上清。
第三、四、五次分別用75ml蒸餾水洗www.med126.com。
將沉淀物懸浮于總體積為175ml蒸餾水中,混勻,分裝,4℃保存。
1.1.6 正常人血清
分別收集20份以上正常人血于干燥滅菌的玻璃瓶中,待血凝固后,放于37℃保溫5~6小時(shí),置4℃冰箱過(guò)液,分離血清,混勻,定量分裝(0.5ml/安瓿),冷凍干燥,-20℃保存。
用時(shí),取凍干品1支,按標(biāo)示量加蒸餾水溶解,然后用咪唑緩沖液作1∶10稀釋,4℃冰箱過(guò)夜(使血清活化),試驗(yàn)當(dāng)日再用咪唑緩沖液作最適濃度稀釋(一般為1∶20),置冰浴備用。
1.1.7 牛Ⅴ因子
收集公牛血于干燥滅菌的玻璃容器中,室溫放置4小時(shí),離心(2500r/min,30分鐘),分離血清,取血清加10%(g/ml)BaSO4在室溫下攪拌吸附40分鐘,離心(2500r/min,40分鐘),棄沉淀,定量(1ml/瓶)分裝,冷凍干燥,-20℃保存。
用時(shí)取凍干品1支,按標(biāo)示量加蒸餾水溶解,用生理鹽水作最適濃度稀釋(一般為1∶20),置冰浴備用。
1.1.8 磷脂
取新鮮腦(人,牛,兔),除去表面血管、腦膜,盡可能除去白質(zhì),切成薄片,稱重,輕輕搗碎,用3倍腦組織的丙酮提取5次,每次用雙層綢布濾干,最后腦粉于37℃干燥1小時(shí),稱取腦粉1g,加20ml氯仿提取,于室溫振搖2小時(shí)后,用單層濾紙過(guò)濾,濾液放抽氣柜內(nèi)用吹內(nèi)機(jī)吹至微干,加10ml生理鹽水研制成白色均勻乳狀液,定量(0.1ml/瓶)分裝,冷凍干燥,-20℃保存。
用時(shí),取凍干品1支,按標(biāo)示量加蒸餾水溶解后,用鹽水作最適濃度稀釋(一般為1∶100~1∶500),置冰浴備用。
1.1.9 基質(zhì)血漿
正常枸櫞酸血漿,按3ml分裝,-20℃保存。
1.2標(biāo)準(zhǔn)品和樣品。
2 操作
2.1試劑混合
取稀釋人血清、Ⅴ因子、磷脂等量混合,置冰浴30分鐘后備用。
2.2標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的準(zhǔn)備和稀釋
2.2.1 若試驗(yàn)血漿對(duì)標(biāo)準(zhǔn)血裝(標(biāo)準(zhǔn)血漿為未吸附者):二者按1ml血漿加0.1ml Al(OH)3懸浮液混合,置37℃水浴吸附3分鐘,離心取上清備用。
2.2.2 試驗(yàn)血漿對(duì)濃縮標(biāo)準(zhǔn)或試驗(yàn)濃制品對(duì)標(biāo)準(zhǔn)血漿:用Ⅷ因子嚴(yán)重缺乏的血漿(Ⅷ因子含量<1%)稀釋濃縮標(biāo)準(zhǔn)品或試驗(yàn)濃制品使成0.5~1.0IU/ml,然后按2.2.1法進(jìn)行吸附處理。
2.2.3濃縮試驗(yàn)品對(duì)濃縮標(biāo)準(zhǔn)品:直接溶解稀釋成0.5~1.0IU/ml。
2.2.4標(biāo)準(zhǔn)品和檢品準(zhǔn)備好后,立即用枸櫞酸鹽一氯化鈉溶液分別作3個(gè)連續(xù)倍倍稀釋,使最低和最高稀釋度的凝結(jié)時(shí)間在17~35秒間(一般為1∶16~1∶256)
2.3 測(cè)定
2.3.1 第一步,混合物的保溫
取7支玻璃凝集管放入冰浴中,每管加0.3ml混合試劑,然后于第1、2、3管分別加高、中、低稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品各0.1ml,第4、5、6管分別加高、中、低稀釋度的樣品各0.1ml,第7管加枸櫞酸鹽-氯化鈉溶液0.1ml(作空白);從第1管開始逐管移入37℃水浴,加0.05mol /L預(yù)溫CaCl2溶液0.1ml,混勻,記時(shí)。每管移入37℃水浴及加CaCl2溶液的時(shí)間間隔均為1分鐘。
2.3.2 第二步,凝血酶原激活物生成量的測(cè)定(取樣時(shí)間以15分鐘和21分鐘為例)
另取13支凝集管,每管各加入0.025mol/l CaCl2溶液0.2ml,當(dāng)?shù)谝徊降?管保溫至12分鐘時(shí),將此13支凝集管和1支裝有基質(zhì)血漿的試管放入37℃水浴中,待混合物保溫至14分鐘40秒時(shí),從第1保溫管中取出0.1ml混合物加到1支含有0.025mol/l CaCl2溶液的凝集管中,于15分鐘時(shí),加入0.2ml基質(zhì)血漿混勻,另用一只秒表記錄從基質(zhì)血漿加入到纖維蛋白形成所需的時(shí)間(纖維蛋白形成可用肉眼觀察,也可用儀器測(cè)量),其余各管每隔1分鐘如此依次進(jìn)行,并于第21~26分鐘作第二系列測(cè)定,兩系列所測(cè)得凝結(jié)時(shí)間不應(yīng)相差5%(說(shuō)明穩(wěn)定的凝血酶原激活物已形成,否則保溫時(shí)間應(yīng)調(diào)整)。空白管于第27分鐘時(shí)取樣測(cè)定。
為了消除試驗(yàn)順序誤差,將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的試驗(yàn)順序改變,2.3.1及2.3.2項(xiàng)過(guò)程重復(fù)一次。
2.4 計(jì)算
2.4.1 作圖法
用雙對(duì)數(shù)紙,以凝結(jié)時(shí)間(秒)為縱坐標(biāo),稀釋度(如25%、50%、100%……)為橫坐標(biāo),分別將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品兩套試驗(yàn)結(jié)果的平均凝結(jié)時(shí)間作兩條平行線,從100%含量的稀釋度處作一垂直線與試驗(yàn)線相交,通過(guò)交點(diǎn)作一水平線與標(biāo)準(zhǔn)線相交,再通過(guò)交點(diǎn)作一垂直線與橫坐標(biāo)相交,其交點(diǎn)讀數(shù)即為試驗(yàn)樣品相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品的百分含量。若標(biāo)準(zhǔn)線和試驗(yàn)線的直線性、平行關(guān)系有顯著性差異,或空白試驗(yàn)小于40秒,則分析結(jié)果無(wú)效。
2.4.2 用3.3平行線法公式計(jì)算
樣品效價(jià)(IU/ml)=log-1(I·V/W)標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)·樣品稀釋倍數(shù)×D值
I=0.301(2倍系列稀釋法的常數(shù))
V=1/3(T1+T2+T3-S1―S2―S3)
T1、T2、T3為樣品3個(gè)倍倍稀釋度的凝固時(shí)間(秒)
S1、S2、S3為標(biāo)準(zhǔn)品3個(gè)倍倍稀釋度的凝固時(shí)間(秒)
若V為負(fù)值,變?yōu)檎岛笤俅肷厦婀接?jì)算,若V為正值,變成負(fù)值后再代入上面公式計(jì)算。
W=1/4(T3-T1+S3-T1)
D值=標(biāo)準(zhǔn)品的最大稀釋度/樣品的最大稀釋度
3 注意事項(xiàng)
3.1因Ⅷ因子易變不穩(wěn)定,因此在進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的稀釋時(shí),應(yīng)快而準(zhǔn)確,稀釋后立即檢定,冰浴中不得放置30分鐘以上。
3.2試驗(yàn)中各試劑的最適稀釋度和混合物保溫時(shí)間隨試劑的變化而異,故應(yīng)作試驗(yàn)預(yù)測(cè),稀釋試劑應(yīng)在冰浴中放置,使用時(shí)間超過(guò)半天應(yīng)重新配制。