ICC染色結(jié)果判斷與其它組織化學(xué)相似，應(yīng)在熟悉所應(yīng)用方法、抗體的優(yōu)點(diǎn)和局限性的基礎(chǔ)上，避免主觀意識(shí)，進(jìn)行客觀判斷。一般認(rèn)為在嚴(yán)格操作、控制染色的條件，選擇特異性抗體等條件下，所得結(jié)果是陽(yáng)性時(shí)才有積極意義。而陰性時(shí)，不一定意味著該物質(zhì)或抗原不存在，即不能排www.med126.com除實(shí)驗(yàn)過(guò)程所致的抗原丟失或抗體選擇不當(dāng)?shù)纫鹑斯ぜ傧蟆Ａ硗飧鶕?jù)ICC染色強(qiáng)弱做半定量分析時(shí)，必須是同時(shí)固定、相同的組織塊、相鄰/同一切片，在嚴(yán)格控制抗體用量和顯色時(shí)間等條件下，進(jìn)行圖象測(cè)定，否則無(wú)法相互比較。鏡檢時(shí)，首先從對(duì)照標(biāo)本開(kāi)始，判斷固定是否合適、非特異性著色強(qiáng)弱等再?gòu)牡捅吨粮弑俄樞蛴^察實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，預(yù)期陽(yáng)性部位是否被染色，不該含此類物質(zhì)的部位是否陰性等。一般認(rèn)為，切片邊緣的較強(qiáng)染色，屬于非特異性著色，所以應(yīng)避免作為陽(yáng)性結(jié)果的依據(jù)。同時(shí)應(yīng)結(jié)合對(duì)照實(shí)驗(yàn)、鑒別假陽(yáng)性，以便做出正確判斷。
1．常用的吸收實(shí)驗(yàn)分固相吸收和液相吸收兩種（見(jiàn)本書第一章 )，對(duì)于不能形成沉淀，難以用離心沉降法分離的一些小分子多肽類抗原，以固相吸收為佳。一般市售抗體均經(jīng)特異性檢測(cè)，所以應(yīng)用購(gòu)買抗體時(shí)可省略此步。
2．交叉實(shí)驗(yàn) 我們知道，引起機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)的并非是免疫原整個(gè)分子，而是其中的一部份—抗原決定簇。每個(gè)抗原可能有不同的抗原決定簇，不同的抗原亦可能有類似的抗原決定簇，因此一種抗血清可能與幾種抗原結(jié)合。所以同時(shí)最好亦用結(jié)構(gòu)相近的抗原做吸收實(shí)驗(yàn)，以避免抗原間的交叉反應(yīng)。
3．替代實(shí)驗(yàn) 用制備第一抗體相同種屬的正常血清（1/10或相同IgG濃度)替代第一抗體或用第二抗體相同種屬的正常血清替代酶標(biāo)抗體/橋抗體或省略其中任何一種免疫試劑或酶等，以PBS代替之，分別孵育切片，結(jié)果均應(yīng)為陰性。
4．置換實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用無(wú)關(guān)的特異性抗體代替第一抗體，孵育切片，結(jié)果應(yīng)陰性。如果同時(shí)進(jìn)行幾種特異性抗體的ICC染色時(shí)，彼此之間即為此類對(duì)照。例如，無(wú)關(guān)的數(shù)種抗體，均在相同部位出現(xiàn)類似陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，非特異性著色的可能性較大，應(yīng)慎重判斷。
5．陽(yáng)性對(duì)照 不具有ICC染色經(jīng)驗(yàn)者，從事此項(xiàng)工作時(shí)，最好同時(shí)染色已知陽(yáng)性標(biāo)本，以排除操作過(guò)程失誤所致的染色陰性。陽(yáng)性標(biāo)本切片最好冰凍保存?zhèn)溆谩?/p>
另外，在觀察新的組織抗原時(shí)，最好同時(shí)比較不同的固定的組織標(biāo)本、冰凍切處及石蠟切片的ICC染色，選擇最佳條件，以期得到良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
組織成分與各種染色試劑及抗血清之間的非特異性結(jié)合稱假陽(yáng)性，其主要原因和處理方法如下：
1．組織細(xì)胞內(nèi)色素 與DAB沉淀物顏色類似的色素，例如黑質(zhì)內(nèi)的神經(jīng)黑色素，不易與反應(yīng)產(chǎn)物區(qū)別開(kāi)來(lái)。可用其它電子供體或免疫熒光技術(shù)鑒別之，亦可改用ALP代替HRP，進(jìn)行染色。
2．假過(guò)氧化物酶活性RBC內(nèi)的血紅素輔基有類過(guò)氧化物酶活性，當(dāng)組織內(nèi)存在紅細(xì)胞時(shí)，即使不加過(guò)氧化酶，亦可出現(xiàn)陽(yáng)性染色。用甲醇-0.3%H2O2孵育標(biāo)本15～20min（室溫)，能抑制這種假陽(yáng)性。甲醇可以使血紅素蛋白中的（亞鐵)血紅素游離，后者被H2O2破壞，從而抑制類過(guò)氧化物酶的活性。一般認(rèn)為，RBC的染色容易同其它組織細(xì)胞區(qū)別，且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還可通過(guò)灌注沖洗組織內(nèi)的RBC，所以此步往往被省略。
3．內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等存在內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，能夠與DAB-H2O2反應(yīng)，導(dǎo)致假陽(yáng)性，所以含此類細(xì)胞較豐富的脾臟、肝臟、骨髓等組織，ICC染色時(shí)，最好做內(nèi)源性酶阻斷。適當(dāng)?shù)墓潭�、�?jīng)酸酒精孵育15～20min，或1%乙酸-甲醇硝基鐵氰化物處理，冰凍切片可用苯肼孵育15～20min，均能不同程度地抑制內(nèi)源性酶的活性。近年Li(1987)報(bào)告，應(yīng)用0.1%NaN3 0.3%-- H2O2孵10～15min（室溫)能較好地抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，冰凍切片效果尤佳。嗜酸性粒細(xì)胞內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性較強(qiáng)，上述各種處理后，仍殘留部分活性，此種情況，在DAB-H2O2顯色液中加入終濃度為0.05NaN3,基本上可達(dá)到完全阻斷的作用。但是，各種封閉內(nèi)源性（假)過(guò)氧化物酶方法均不同程度地破壞組織的抗原性，所以在不影響反應(yīng)結(jié)果判斷或能夠同內(nèi)源性酶的反應(yīng)所致的假陽(yáng)性區(qū)別時(shí)，盡量避免此類處理或改用ALP代替HRP進(jìn)行ICC染色，也可以在用第一抗體與抗原反應(yīng)結(jié)合后，再進(jìn)行消除內(nèi)源酶的處理。
4．游離醛基醛類固定的組織切片上，可能存在些游離醛基，后者能與蛋白質(zhì)（含IgG)間非特異性結(jié)合，導(dǎo)致假陽(yáng)性，用白蛋白或封閉性阻斷等預(yù)先孵育切片，可封閉之。
5．疏水鍵和離子鍵免疫球蛋白可通過(guò)疏水鍵或離子鍵與組織中的堿性蛋白或Fc受體（冰凍切片F(xiàn)c受體保存尤佳)非特異性結(jié)合。用正常血清（制備第二抗體種屬的血清為首選)，于第一抗體前孵育切片，可消除之�！�4”和“5”重疊應(yīng)用，更有利于降低背景染色。
6．天然抗體及不純抗體 天然抗體是指因動(dòng)物自然感染等原因血清中存在的部分抗體：不純抗體是指在制備血清時(shí)，所用的抗原不純，獲得的抗體含有雜質(zhì)抗體。當(dāng)天然抗體或不純抗體與組織成分結(jié)合時(shí)，可引起非特異性染色。上述二者的含量均較低，增加第一抗體的稀釋度，可以降低其非特異性染色。
7．載體蛋白抗體 制備小分子多肽（分子量小于4kD)的抗體時(shí)，需借助載體蛋白，使小分子多肽獲得免疫原性，刺激動(dòng)物產(chǎn)生特異性抗體。因載體本身具有抗原性，故動(dòng)物同時(shí)也產(chǎn)生抗載體蛋白抗體，與組織蛋白結(jié)合后，引起背景染色。用固相吸收技術(shù)，能將載體蛋白抗體除去。一般市售抗體，均經(jīng)特異性檢測(cè)，所以“6”和“7”可不必考慮。
1．血清特異性檢測(cè) 為了發(fā)現(xiàn)新的物質(zhì)或其它方法未能顯示的物質(zhì)、而又無(wú)相應(yīng)抗體可購(gòu)買時(shí)，往往需要自己制備抗血清。制備時(shí)應(yīng)檢測(cè)抗血清的特異性。常用的方法有：
（1)放射免疫分析（RIA)、免疫擴(kuò)散或電泳及ICC法：在制備抗血清的過(guò)程中 ，用RIA和免疫電泳等方法檢測(cè)抗血清的效價(jià)是不可少的。一般認(rèn)為，RIA和免疫電泳的最佳稀釋度較高。ICC染色時(shí)，應(yīng)從其1%的稀釋度試用之較合適。在制備ICC用抗血清時(shí)，最好在應(yīng)用RIA和免疫電泳法的同時(shí)結(jié)合ICC染色，以鑒定抗血清的質(zhì)量（制備單克隆抗體時(shí)，僅用ICC染色篩選特異克隆即可)。因?yàn)槊庖哌^(guò)程中，各個(gè)時(shí)期抗血清效價(jià)不同的，例如給動(dòng)物免疫催產(chǎn)素，7周時(shí)血清ICC染色較好，RIA不佳；在10～12周期間，RIA效價(jià)升高，但I(xiàn)CC染色較差。因此制備ICC用抗血清時(shí)，應(yīng)在ICC染色效價(jià)最佳時(shí)，收集抗血清。
（2)系列稀釋第一抗體法：在一定稀釋度時(shí)，抗體的特異性結(jié)合最強(qiáng)；繼續(xù)增加抗體的稀釋度，特異性反應(yīng)將隨之減弱至消失。因此采用系列稀釋第一抗體的方法，能夠驗(yàn)證抗血清的特異性。
2．抗體的選擇 原則上應(yīng)選擇在較高稀釋度時(shí)染色較佳而背景較低、結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)再現(xiàn)良好的抗體。目前供ICC研究用的抗種類繁多，制造商如林，不同的廠家的相同抗體，其價(jià)格、包裝及抗體的最佳工作濃度，差異較大。所以選購(gòu)時(shí)，應(yīng)多聽(tīng)取有經(jīng)驗(yàn)者的建議，參考文獻(xiàn)報(bào)告，并且自己應(yīng)多查找不同廠家的抗體商品目錄，恰當(dāng)?shù)剡x購(gòu)自己所需的抗體。
3．抗體最佳稀www.med126.com釋度的檢測(cè) 抗原抗體反應(yīng)要求一定比例，過(guò)量或不足，均不能達(dá)到預(yù)期的結(jié)果，所以ICC染色時(shí)，應(yīng)進(jìn)行抗體最佳稀釋度的檢測(cè)。市售抗體所附說(shuō)明書均標(biāo)有工作液濃度，但實(shí)際上，廠商常常給較低的稀釋倍數(shù)，因此應(yīng)用時(shí)，可將所給工作液濃度稀釋數(shù)倍至數(shù)百倍再進(jìn)行系列染色，選擇其中特異性染色最強(qiáng)、背景著色最低的釋釋度作日常ICC染色濃度。在抗體來(lái)源不明、又無(wú)任何可供參考依據(jù)時(shí)，則可從原液至數(shù)倍稀釋試用。另外，酶標(biāo)抗體/連結(jié)抗體和PAP復(fù)合物等也需要確定最佳工作液濃度。一般認(rèn)為酶標(biāo)抗體可用稍離濃度，例如HRP標(biāo)記抗體為1：80～160、ALP標(biāo)記抗體為1：50～100染色較理想。PAP法染色時(shí)，連結(jié)抗體稀釋1：50、PAP復(fù)合物用1：50～200染色較合適。
4．抗體的保存 為確保ICC染色結(jié)果穩(wěn)定、再現(xiàn)性良好，應(yīng)避免抗體反復(fù)凍融所致的效價(jià)降低。第一抗體分裝、冷凍保存為佳，其最小包裝可為每次用量或2周內(nèi)用量。例如某抗體的工作液濃度1：1000～2000，每次染色需抗體量為1～4ml時(shí)，則所需原液為1～2μl。將原液分裝成幾微升難度較大，所以先將原液稀釋為1：10～100，每支離心管內(nèi)10～100μl保存，應(yīng)用前稀釋至工作液濃度。后者不宜冰凍，4℃可保存2～3周，原液和1：10～100的抗體在-80℃可保存數(shù)年而染色結(jié)果不變。單克隆抗體為培養(yǎng)液上清或腹水時(shí)，應(yīng)4℃保存，應(yīng)早應(yīng)用。酶標(biāo)抗體和PAP復(fù)合物原液4℃保存1年左右，免疫活性和酶活性不發(fā)生改變，大量制備的酶標(biāo)抗體/PAP復(fù)合物最好分裝后于-80℃或-20℃保存。所分裝的抗體，應(yīng)注明名稱，稀釋度、量及日期等，同時(shí)應(yīng)在筆記本詳細(xì)記錄。ICC研究所用的任何抗體及酶，均應(yīng)嚴(yán)格記錄，妥善管理，才能保證實(shí)驗(yàn)成功。
在單克隆抗體問(wèn)世前，ICC染色中通常所用的抗血清均為多克隆抗體，即抗血清含有多少B淋巴細(xì)胞株所分泌的抗體，這些抗體的性質(zhì)不完全相同，不同的抗血清之間可能有交叉反應(yīng)，使ICC染色受到一定限制。近年，單克隆抗體的引入，特別是市售單克隆抗體和種類和數(shù)量的迅猛發(fā)展，及各實(shí)驗(yàn)者比較容易制備自己所需的單克隆抗體，為ICC染色在特殊抗原定位、生物活性檢測(cè)、腫瘤標(biāo)記識(shí)別中，開(kāi)辟了更廣闊的前景。
1．單克隆抗體的制備（Oi,TV, 1980)(詳見(jiàn)第一章 )。
2．單克隆抗體的特點(diǎn)
（1)酶標(biāo)抗體：自己制備或市售商的單克隆抗體，絕大部分為小鼠IgG、Kappa型，所以酶標(biāo)抗體選擇抗小鼠IgG的多價(jià)抗體，進(jìn)行ICC染色比較穩(wěn)妥。
（2)特異性：專一性強(qiáng)：?jiǎn)慰寺】贵w是由同一細(xì)胞株分泌的，性質(zhì)均一，且有相同的親合力，識(shí)別同一抗原決定簇。這在研究某些類似物質(zhì)的局部定位、分型、生物活性檢測(cè)及腫瘤診斷等方面有重要意義。但同時(shí)也應(yīng)注意，不同抗原的相同抗原決定簇有被識(shí)別的可能，所以應(yīng)結(jié)合其它方法，判斷其結(jié)果。
（3)不需純化抗原：多克隆抗血清在制備時(shí)，要求抗原相當(dāng)純。而制備單克隆抗體時(shí)，不需純化抗原。一些不能純化的組織（游離)細(xì)胞可直接免疫，經(jīng)克隆化，篩選所需細(xì)胞株，避免了純化抗原的麻煩，這在研究人類各種疾病等有重要價(jià)值。
（4)工作液濃度：不同的單克隆抗體效價(jià)各異，所以ICC染色時(shí)需檢測(cè)最佳稀釋倍數(shù)，大量培養(yǎng)純化的抗體可用更高的稀釋倍數(shù)。
（5)切片選擇：?jiǎn)慰寺】贵w僅識(shí)別抗原物質(zhì)的某一抗原決定簇，所以以新鮮組織的冰凍切片為首選。因?yàn)樵诠潭ㄟ^(guò)程中，可能使抗原物質(zhì)發(fā)生某些改變，致使其與單克隆抗體反應(yīng)的抗原決定簇丟失，故擬用石蠟切片固定組織冰凍切片。ICC染色時(shí)，在制備單克隆抗體過(guò)程中，應(yīng)該用同樣標(biāo)本和方法篩選所需細(xì)胞株，才能確保染色成功。
（6)特異性檢測(cè)：?jiǎn)慰寺?抗體的特異性強(qiáng)，性質(zhì)均一，沒(méi)有必要進(jìn)行RIA分析和吸收實(shí)驗(yàn)等。自己制備的單克隆抗體，其特異性檢測(cè)最佳方法為相同組織提取物質(zhì)進(jìn)行免疫電泳，確定抗原的分子量等。
（7)發(fā)現(xiàn)新物質(zhì)：在制備腫瘤或其它組織細(xì)胞單克隆抗體時(shí)，往往有各種各樣的抗原特異性雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生，在篩選過(guò)程中，能夠發(fā)現(xiàn)一些新的雜交瘤株，經(jīng)培養(yǎng)制備相應(yīng)的抗體，用于一些新領(lǐng)域的研究。
通常染色、著色較弱時(shí)，應(yīng)想辦法改進(jìn)標(biāo)本的處理的抗原的保存，提高抗體的穿透力，再重新染色。但有時(shí)組織本身抗原含量較少或標(biāo)本難得（如手術(shù)材料)，可嘗試下述方法以提高染色強(qiáng)度，確保染色成功。
1．重復(fù)顯色一般認(rèn)為，對(duì)ALP標(biāo)記抗體，延長(zhǎng)顯色時(shí)間其反應(yīng)可增強(qiáng)。但在同一染色液中延長(zhǎng)顯色時(shí)間，往往容易產(chǎn)生沉淀，出現(xiàn)終產(chǎn)物彌散現(xiàn)象。所以重新配制顯色液繼續(xù)呈色，第二孵育時(shí)間可縮短至4～5min，能提高部分染色強(qiáng)度。
HRP標(biāo)記時(shí)，重復(fù)呈色無(wú)明顯增強(qiáng)效應(yīng)。通常在顯色液中加入0.01mol/l Imidazole 或改用酸性緩沖液（pH5.5～6.0)，可提高染色強(qiáng)度；亦可在DAB反應(yīng)后，1%OSO4浸泡固定5～15min，繼之0.4%亞鐵氰化鉀/0.1N HCl液處理5min，DAB終產(chǎn)物呈黑色，與背景的對(duì)比度較佳。另外，在間接法顯色較弱時(shí)，亦可試用PAP法、ABC法等，探索較合適的染色方法。
2．重復(fù)第一抗體在漂洗過(guò)程中，結(jié)合力弱的抗體易離解丟失，重復(fù)應(yīng)用第一抗體有利于抗體與組織抗原結(jié)合，增加抗體數(shù)量，提高染色強(qiáng)度（Noorden 1983)。切片經(jīng)第一抗體孵育后，漂洗，再孵育第一抗體（此時(shí)第一抗體可稀釋較原工作濃度1至數(shù)倍)2～4h，然后經(jīng)酶標(biāo)抗體孵育，呈色觀察同前。所用抗體為多克隆血清時(shí)，提高第一抗體的稀釋度，重復(fù)孵育2～3次，可得到一定效果。單克隆抗體，經(jīng)第一抗體—酶標(biāo)抗體—第一抗體—酶標(biāo)抗體，也能增加染色強(qiáng)度。
3．雙橋PAP法（Vacca 1982) 基本操作與單橋法相似，所不同的是切片經(jīng)單橋PAP復(fù)合物孵育后，漂洗，再孵育橋抗體和PAP復(fù)合物（均可稀釋1倍)，即切片經(jīng)兩次橋抗體、兩次PAP孵育—雙橋法（Double bridged technique)。據(jù)報(bào)告，第一抗體用較高稀釋度（例單橋法兩倍)，也能獲得與雙橋法相近的染色效果。
理論上講，雙橋法是ICC染色中較為敏感的方法，它較單橋法靈敏20～50倍，能夠增加抗原的顯示數(shù)量（25%)和反應(yīng)終產(chǎn)物的大小。這在研究胚胎發(fā)育過(guò)程中一些抗原含量較低的組織時(shí)，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。雙橋法可能是通過(guò)下列途徑提高其敏感性的：①重復(fù)的橋抗體與PAP復(fù)合物中的抗HRP抗體的未飽和抗原位置結(jié)合，再連結(jié)另外的PAP復(fù)合物，在抗原部位抗體間彼此結(jié)合形成較大的抗原抗體復(fù)合物，具有多個(gè)酶分子（圖4-9A)，使反應(yīng)增強(qiáng)。這可能是雙橋法敏感性增高的主要機(jī)制；②重復(fù)的橋抗體與第一抗體未飽和的抗原位置結(jié)合，使第一抗體上結(jié)合較多的橋抗體及PAP復(fù)合物（圖4-9B)。但PAP復(fù)合物較大，應(yīng)設(shè)法提高其穿透性，達(dá)到增加染色強(qiáng)度的目的。
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圖4-9 雙橋PAP法的兩種放大原理
4．半抗原夾層法（Hapten Sandwich Method) 首先用半抗原（FITC等)標(biāo)記的第一抗體與組織抗原結(jié)合，繼之用HRP（或ALP)標(biāo)記的抗FITC抗體與組織抗原結(jié)合的FITC的反應(yīng)，呈色后觀察抗原存在部位。FITC為一種熒光色素，熒光顯微鏡下呈亮綠色熒光，所以也可以同時(shí)觀察免疫熒光染色結(jié)果。FITC特異熒光褪色后，其抗原性仍不丟失，從這種角度講，熒光抗體法的切片亦能半永久保存。該法較一般間接法敏感性高，最大優(yōu)點(diǎn)是不管第一抗體來(lái)自何種屬，只要與FITC連結(jié)，均可被同一酶標(biāo)記的抗FITC抗體識(shí)別。避免了準(zhǔn)備不同種屬的酶標(biāo)抗體的麻煩，而且FITC標(biāo)記抗體技術(shù)成熟、穩(wěn)定，商品種類多，容易購(gòu)買，實(shí)驗(yàn)者不妨一試。
