免疫學(xué)和免疫學(xué)檢驗:第一節(jié)　放射免疫分析

放射免疫分析是由Yalow和Berson于1960年創(chuàng)建的標(biāo)記免疫分析技術(shù)。由于標(biāo)記物放射性核素的檢測靈敏性，本法的靈敏度高達(dá)ng甚至pg水平。測定的準(zhǔn)確性良好，ng量的回收率接近100％。本法特別適用于微量蛋白質(zhì)、激素和多肽的定量測定。

一、基本原理

放射免疫分析的基本原理是標(biāo)記抗原（Ag^*)和非標(biāo)記抗原（Ag)對特異性抗體（Ab)的競爭結(jié)合反應(yīng)。它的反應(yīng)式為：

在這一反應(yīng)系統(tǒng)中，作為試劑的標(biāo)記抗原和抗體的量是固定的。抗體的量一般取用能結(jié)合40％～50％的標(biāo)記抗原，而受檢標(biāo)本中的非標(biāo)記抗原是變化的。根據(jù)標(biāo)本中抗原量的不同，得到不同的反應(yīng)結(jié)果。

假設(shè)受檢標(biāo)本中不含抗原時的反應(yīng)條件為：

4（Ag^*)＋2（Ab)→2（Ag^*Ab)＋2（Ag^*)（2)

在標(biāo)本中存在抗原時，舉例如下：

4（Ag^*)＋4（Ag)＋（2Ab)→

1（Ag^*Ab)＋3（Ag^*)＋1（AgAb)＋3（Ag)（3)

當(dāng)標(biāo)記抗原、非標(biāo)記抗原和特異性抗體三者同時存在于一個反應(yīng)系統(tǒng)時，由于標(biāo)記抗原和非標(biāo)記抗原對特異性抗體具有相同的結(jié)合力，因此兩者相互競爭結(jié)合特異性抗體。由于標(biāo)記抗原與特異性抗體的量是固定的，故標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物形成的量就隨著非標(biāo)記抗原的量而改變。非標(biāo)記抗原量增加，相應(yīng)地結(jié)合較多的抗體，從而抑制標(biāo)記抗原對抗體的結(jié)合，使標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物相應(yīng)減少，游離的標(biāo)記抗原相應(yīng)增加，亦即抗原抗體復(fù)合物中的放射性強(qiáng)度與受檢標(biāo)本中抗原的濃度呈反比（圖16-1)。若將抗原抗體復(fù)合物與游離標(biāo)記抗原分開，分別測定其放射性強(qiáng)度，就可算性結(jié)合態(tài)的標(biāo)記抗原（B)與游離態(tài)的標(biāo)記抗原（F)的比值（B/F)，或算出其結(jié)合率[B/(B＋F)]，這與標(biāo)本中的抗量呈函數(shù)關(guān)系。用一系列不同劑量的標(biāo)準(zhǔn)抗原進(jìn)行反應(yīng)，計算相應(yīng)的B/F，可以繪制出一條劑量反應(yīng)曲線（圖16-2)。受檢標(biāo)本在同樣條件下進(jìn)行測定，計算B/F值，即可在劑量反應(yīng)曲線上查出標(biāo)本中抗原的含量。

圖16-1 放射免疫分析原理示意圖

圖16-2 劑量反應(yīng)曲線

（一)標(biāo)記物

標(biāo)記用的核素有放射γ射線和β射線兩大類。前者主要為¹³¹I、¹²⁵I、⁵⁷Cr和⁶⁰Co；后者有¹⁴C、³H和³²P。放射性核素的選擇首先考慮比活性。例如¹²⁵I比活性的理論值是64.38×10⁴GBq/g（1.74×10⁴Ci/g)，有較長半衰期的¹⁴C最大比活性是166.5GBq/g（4.5Ci/g)。兩者相比，1mol¹²⁵I或¹⁴C結(jié)合到抗原上，¹²⁵I的敏感度約比¹⁴C大3900倍。又因為¹²⁵I有合適的半衰期，低能量的γ射線易于標(biāo)記，因而¹²⁵I是目前常用的RIA標(biāo)記物。

（二)標(biāo)記方法

標(biāo)記¹²⁵I的方法可分兩www.med126.com大類，即直接標(biāo)記法和間接標(biāo)記法。

直接標(biāo)記法是將¹²⁵I直接結(jié)合于蛋白質(zhì)側(cè)鏈殘基的酪氨酸上。此法優(yōu)點是操作簡便，為¹²⁵I和蛋白質(zhì)的單一步驟的結(jié)合反應(yīng)，它能使較多的¹²⁵I結(jié)合在蛋白質(zhì)上，故標(biāo)記物具有高度比放射性。但此法只能用于標(biāo)記含酪氨酸的化合物。此外，含酪氨酸的殘基如具有蛋白質(zhì)的特異性和生物活性，則該活性易因標(biāo)記而受損傷。

間接標(biāo)記法（又稱連接法)是以¹²⁵I標(biāo)記在載體上，純化后再與蛋白質(zhì)結(jié)合。由于操作較復(fù)雜，標(biāo)記蛋白質(zhì)的比放射性顯著低于直接法。但此法可標(biāo)記缺乏酪氨酸的肽類及某些蛋白質(zhì)。如直接法標(biāo)記引起蛋白質(zhì)酪氨酸結(jié)構(gòu)改變而損傷其免疫及生物活性時，也可采用間接法。它的標(biāo)記反應(yīng)較為溫和，可以避免因蛋白質(zhì)直接加入¹²⁵I液引起的生物活性的喪失。下面介紹最常用的氯胺T直接標(biāo)記法。

氯胺T是對甲苯磺基酰胺的N-氯衍生物的鈉鹽，在水溶液中逐漸分解形成次氯酸，是一種氧化劑。在偏堿溶液中（pH7.5)，氯胺T將¹²⁵I的I^－氧化為I⁺，I⁺取代蛋白質(zhì)酪氨酸苯環(huán)的氫，形成二碘酪氨酸。反應(yīng)式如下：

放射性碘標(biāo)記率的高低與抗原（蛋白質(zhì)或多肽)分子中酪氨酸的含量及分子中酪氨酸的暴露程度有關(guān)，當(dāng)分子中含有較多的酪氨酸，又暴露在外時，則標(biāo)記率就高。

標(biāo)記方法：將純化抗原和¹²⁵I加入小試管底部，然后將新鮮配制的氯胺T快速沖入，混勻振蕩數(shù)十秒～2min后加入偏重亞硫酸鈉終止反應(yīng)。再加入KI溶液稀釋。然后在葡聚糖G柱上分離，逐管收集。分別用井型閃爍計數(shù)器測定放射性強(qiáng)度（脈沖數(shù)/min,cpm)，前部為標(biāo)記抗原峰，后部為游離¹²⁵I峰。在標(biāo)記抗原峰試管內(nèi)加等量1％白蛋白作穩(wěn)定劑，此即為標(biāo)記抗原液。

（三)標(biāo)記物的鑒定

1．放射性游離碘的含量用三氯醋酸（預(yù)先在受鑒定樣品中加入牛血清白蛋白)將所有蛋白質(zhì)沉淀，分別測定沉淀物和上清液的cpm值。一般要求游離碘在總放射性碘的5％以下。標(biāo)記抗原在貯存過久后，會出現(xiàn)標(biāo)記物的脫碘，如游離碘超過5％則應(yīng)重新純化去除這部分游離碘。

2．免疫活性標(biāo)記時總有部分抗原活性損失，但應(yīng)盡量避免。檢查方法是用小量的標(biāo)記抗原加過量的抗體，反應(yīng)后分離B和F，分別測定放射性，算出BT％。此值應(yīng)在80％以上，該值越大，表示抗原損傷越少。

3．放射性比度標(biāo)記抗原必須有足夠的放射性比度。比度或比放射性是指單位重量抗原的放射強(qiáng)度。標(biāo)記抗原的比放射性用mCi/mg（或mCi/mmol)表示。比度越高，測定越敏感。標(biāo)記抗原的比度計算是根據(jù)放射性碘的利用率（或標(biāo)記率)：

如：5μghGH用2mCiNa¹²⁵I進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記率為40％，則

（四)抗血清的檢定

含有特異性抗體的抗血清是放射免疫分析的主要試劑，常以抗原免疫小動物誘發(fā)產(chǎn)生多克隆抗體而得�？寡�清的質(zhì)量直接影響分析的靈敏度和特異性。抗血清質(zhì)量的指標(biāo)主要有親和常數(shù)、交叉反應(yīng)率和滴度。

1．親和常數(shù)親和常數(shù)（affinityconstant)常用K值表示。它反映抗體與相應(yīng)抗原的結(jié)合能力。K值的單位為mol/L，即表示1mol抗體稀釋至若干L溶液中時，與相應(yīng)的抗原結(jié)合率達(dá)到50％�？寡�清K值越大，放射免疫分析的靈敏度、精密和準(zhǔn)確度越佳�？寡�清的K值達(dá)到10⁹～10¹²mol/L才適合用于放射免疫分析。

2．交叉反應(yīng)率放射免疫分析測定的物質(zhì)有些具有極為類似的結(jié)構(gòu)，例如甲狀腺素的T3、T4，雌激素中的雌二醇、雌三醇等。針對一種抗原的抗血清往往對于其類似物會發(fā)生交叉反應(yīng)。因此交叉反應(yīng)率反映抗血清的特異性，交叉反應(yīng)率過大將影響分析方法的準(zhǔn)確性。交叉反應(yīng)率的測定方法為用與抗血清相應(yīng)抗原及其類似物用同法進(jìn)行測定，觀察置換零標(biāo)準(zhǔn)管50％時的量。以T3抗血清為例，置換零標(biāo)準(zhǔn)50％T3為1ng，其類似物T4則需200ng，則其交叉反應(yīng)率為：1/200＝0.5％。

3．滴度滴度系指將血清稀釋時能與抗原發(fā)生反應(yīng)的最高稀釋度。它反映抗血清中有效zxtf.net.cn/pharm/抗體的濃度。在放射免疫分析中滴度為在無受檢抗原存在時，結(jié)合50％標(biāo)記抗原時抗血清的稀釋度。

二、測定方法

用放射免疫分析進(jìn)行測定時分三個步驟，即抗原抗體的競爭抑制反應(yīng)、B和F的分離及放射性的測量。

（一)抗原抗體反應(yīng)

將抗原（標(biāo)準(zhǔn)品和受檢標(biāo)本)、標(biāo)記抗原和抗血清按順序定量加入小試管中，在一定的溫度下進(jìn)行反應(yīng)一定時間，使競爭抑制反應(yīng)達(dá)到平衡。不同質(zhì)量的抗體和不同含量的抗原對溫育的溫度和時間有不同的要求。如受檢標(biāo)本抗原含量較高，抗血清的親和常數(shù)較大，可選擇較高的溫度（15～37℃)進(jìn)行較短時間的溫育，反之應(yīng)在低溫（4℃)作較長時間的溫育，形成的抗原抗體復(fù)合物較為牢固。

（二)B、F分離技術(shù)

在RIA反應(yīng)中，標(biāo)記抗原和特異性抗體的含量極微，形成的標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物（B)不能自行沉淀，因此需用一種合適的沉淀劑使它徹底沉淀，以完成與游離標(biāo)記抗原（F)的分離。另外對小分子量的抗原也可采取吸附法使B與F分離。

1．第二抗體沉淀法這是RIA中最常用的一種沉淀方法。將產(chǎn)生特異性抗體（第一抗體)的動物（例如兔)的IgG免疫另一種動物（例如羊)，制得羊抗兔IgG血清（第二抗體)。由于在本反應(yīng)系統(tǒng)中采用第一、第二兩種抗體，故稱為雙抗體法。在抗原與特異性抗體反應(yīng)后加入第二抗體，形成由抗原－第一抗體－第二抗體組成的雙抗體復(fù)合物。但因第一抗體濃度甚低，其復(fù)合物亦極少，無法進(jìn)行離心分離，為此在分離時加入一定量的與一抗同種動物的血清或IgG，使之與第二抗體形成可見的沉淀物，與上述抗原的雙抗體復(fù)合物形成共沉淀。經(jīng)離心即可使含有結(jié)合態(tài)抗原（B)的沉淀物沉淀，與上清液中的游離標(biāo)記抗原（F)分離。

將第二抗體結(jié)合在顆粒狀的固相載體之上即成為固相第二抗體。利用固相第二抗體分離B、F，操作簡便、快速。

2．聚乙二醇（PEG)沉淀法最近各種RIA反應(yīng)系統(tǒng)逐漸采用了PEG溶液代替第二抗體作沉淀劑。PEG沉淀劑的主要優(yōu)點是制備方便，沉淀完全。缺點是非常特異性結(jié)合率比用第二抗體為高，且溫度高于30℃時沉淀物容易復(fù)溶。

3．PR試劑法是一種將雙抗體與PEG二法相結(jié)合的方法。此法保持了兩者的優(yōu)點，節(jié)省了兩者的用量，而且分離快速、簡便。

4．活性炭吸附法小分子游離抗原或半抗原被活性炭吸附，大分子復(fù)合物留在溶液中。如在活性炭表面涂上一層葡聚糖，使它表面具有一定孔徑的網(wǎng)眼，效果更好。在抗原與特異性抗體反應(yīng)后，加入葡聚糖－活性炭。放置5～10min，使游離抗原吸附在活性炭顆粒上，離心使顆粒沉淀，上清液中含有結(jié)合的標(biāo)記抗原。此法適用于測定類固醇激素，強(qiáng)心糖苷和各種藥物，因為它們是相對非極性的，又比抗原抗體復(fù)合物小，易被活性炭吸附。

（三)放射性強(qiáng)度的測定

B、F分離后，即可進(jìn)行放射性強(qiáng)度測定。測量儀器有兩類，液體閃爍計數(shù)儀（β射線，如³H、³²P、¹⁴C等)和晶體閃爍計數(shù)儀（β射線，如¹²⁵、¹³¹I、⁵⁷Cr等)。

計數(shù)單位是探測器輸出的電脈沖數(shù)，單位為cpm（計數(shù)/分)，也可用cps（計數(shù)/秒)表示。如果知道這個測量系統(tǒng)的效率，還可算出放射源的強(qiáng)度，即dpm（衰變/分)或dps（衰變/秒)。

每次測定均需作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，以標(biāo)準(zhǔn)抗原的不同濃度為橫坐標(biāo)，以在測定中得到的相應(yīng)放射性強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖（圖16-3)。放射性強(qiáng)度可任選B或F，亦可用計算值B/(B＋F)、B/F和B/B₀。標(biāo)本應(yīng)作雙份測定，取其平均值，在制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖上查出相應(yīng)的受檢抗原濃度。

圖16-3 放射免疫分析標(biāo)準(zhǔn)曲線示例