實用免疫細胞與核酸:第三節(jié)　免疫酶細胞化學技術

一、基本原理

免疫酶細胞化學技術是以酶作為抗原抗體反應的標記物，在既不改變抗原抗體的免疫反應特異性也不影響酶活性的條件下，與相應的酶底物作用，形成一種不溶性的反應產(chǎn)物。在光學顯微鏡下觀察時，要求反應的終末產(chǎn)物是不溶性的有色物質(zhì)，具有可觀察性。在電鏡下觀察時，則要求底物的終末產(chǎn)物具有較高的電子密度。由于辣根過氧化物酶（Horse Radish Peroxidase, HRP)具有穩(wěn)定性強和反應特異性高等優(yōu)點，是目前應用最多的酶標記物。實驗方法包括酶標記抗體法、非標記抗體酶法和非標記的過氧化物酶—抗過氧化物酶技術（即PAP法，見第四章　)。

二、電鏡標本制備方法

免疫酶細胞化學技術可用于包埋前和包埋后染色，但以前者應用較多。

1．單層細胞培養(yǎng)物免疫酶染色法

（1)用4%多聚甲醛（在0.05mol/l 磷酸緩沖液中，pH7.2)在原位固定（4^℃)1h。

（2)用0.05mol/l PBS充分洗滌后，用HRP標記的抗體血清作用18h，再用PBS充分洗滌。

（3)2%戊二醛固定1h，再水洗。

（4)呈色反應，用DAB—H₂O₂呈色反應，水洗。

（5)1%鋨酸后固定30min～1h，原位用環(huán)氧樹脂包埋，光鏡作半薄切片定位，作超薄切片。

2．組織切片酶標記抗體染色法

（1)1mm厚組織塊，在4^℃下用固定液固定后，置于含4.5%的蔗糖PBS（0.05mol/l pH7.2)，4^℃中漂洗，換數(shù)次固定液，過夜。

（2)隨后，作10～40μm的冰凍切片zxtf.net.cn/wszg/，放入第一抗體血清作用12～18h，4℃，用含蔗糖的PBS洗數(shù)次。

（3)置于HRP標記抗體液（第二抗體)4^℃過夜。然后用4℃含蔗糖PBS反復沖洗數(shù)次。4^℃浸漂過夜。

（4)2.5%戊二醛（pH7.4磷酸緩沖液)再固定1h，4^℃用含蔗糖PBS反復沖洗去戊醛，每次5min，共洗3次。

（5)DAB-H₂O₂顯色15～30min。

（6)0.05mol/l PBS沖洗3次，每次30min，再置于室溫中用1%～2%www.med126.com鋨酸固定1h，脫水、包埋、切片復染和觀察。

3．PAP包埋前染色法（Pickel 等，1975)

經(jīng)固定組織、應用振動切片機（Vibratome)切35～50μm厚片，或用組織鋪片，以漂浮法在反應板上進行下列步驟：

（1)正常羊血清（1：30PBS稀釋)，室溫孵育30min。

（2)第一抗體（A種動物抗血清)，4℃濕盒中48～72h。

（3)羊抗A種動物血清（1：100)室溫30min。

（4)A種動物血清PAP復合物（1：100)室溫30min。

（5)DAB·4HCl/H₂O₂(0.05%/0.01%)，室溫1.5min。上述每一步驟后應用PBS洗滌（5min×3次)。

（6)在解剖顯微鏡下檢出免疫反應陽性部位，修整組織，用0.1mol/L磷酸緩沖液稀釋的1%鋨酸（pH7.4)后固定30min～1h。

（7)按常規(guī)電鏡樣品制備，脫水、包埋、超薄切片、染色觀察。

4．PAP包埋后染色法（Ordronneau, 1982)

（1)將載有切片的鎳網(wǎng)（或金網(wǎng))在5%的H₂O₂液中蝕刻（etch)2～3min。生理鹽水沖洗，濾紙吸干。

（2)正常羊血清用0.05mol/L Tris鹽液（TBS)稀釋成1：30，pH7.0，室溫5min 。

（3)兔抗血清（第一抗體)，內(nèi)含1%正常羊血清，用0.05%mol/l Tris緩沖液稀釋，pH7.6,4℃，48h后以Tris緩沖液洗滌。

（4)正常羊血清1：30，室溫5min。

（5)羊抗兔1：10（第二抗體，0.05mol/l Tris緩沖液稀釋，pH7.0)，室溫5min，Tris緩沖液洗滌。

（6)正常羊血清1：30，室溫5min。

（7)兔PAP復合物，內(nèi)含1%正常羊血清，室溫3min,Tris 緩沖液洗滌。

（8)DAB—H₂O₂液顯色（含H₂O₂0.01%～0.03%),室溫3min。

（9)4%的磷酸鹽緩沖的鋨酸溶液10～15min，蒸餾水洗滌（此步用于改善微細結(jié)構(gòu)的反差)，電鏡觀察。

5．PAP免疫電鏡雙重標記

在連續(xù)的超薄切片上進行，用包埋后染色法在相鄰的兩張切片上分別以不同的抗體進行免疫染色�？稍诔�威結(jié)構(gòu)水平判定細胞內(nèi)抗原共存的情況。