免疫學(xué)和免疫學(xué)檢驗(yàn):第二節(jié)　凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)

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最常用的凝膠為瓊脂糖。由于凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)具有高度的敏感性和特異性，且設(shè)備簡單、操作方便，因而得到廣泛應(yīng)用。該試驗(yàn)利用可溶性抗原和相應(yīng)抗體在凝膠中擴(kuò)散，形成濃度梯度，在抗原與抗體濃度比例恰當(dāng)?shù)奈恢眯纬扇庋劭梢姷某恋砭€或沉淀環(huán)。適宜濃度的凝膠可視為一種固…

最常用的凝膠為瓊脂糖。由于凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)具有高度的敏感性和特異性，且設(shè)備簡單、操作方便，因而得到廣泛應(yīng)用。

該試驗(yàn)利用可溶性抗原和相應(yīng)抗體在凝膠中擴(kuò)散，形成濃度梯度，在抗原與抗體濃度比例恰當(dāng)?shù)奈恢眯纬扇庋劭梢姷某恋砭€或沉淀環(huán)。適宜濃度的凝膠可視為一種固相的液體，水分占98％以上，凝膠形成網(wǎng)絡(luò)，將水分固相化。抗原和抗體蛋白質(zhì)在此凝膠內(nèi)擴(kuò)散，猶如在液體中自由運(yùn)動。大分子（分子量為20萬以上)物質(zhì)在凝膠中擴(kuò)散較慢，可利用這點(diǎn)識別分子量的差別。另外，由于瓊脂網(wǎng)孔有一定的限度，抗原抗體結(jié)合后，復(fù)合物的分子量至少應(yīng)在百萬以上，這種超大分子則被網(wǎng)絡(luò)在瓊脂中，經(jīng)鹽水浸泡也只能去除游離的抗原或抗體，這對后面的分析帶來極大的方便。

凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)可根據(jù)抗原與抗體反應(yīng)的方式和特性，分為單向擴(kuò)散試驗(yàn)和雙向擴(kuò)散試驗(yàn)。

一、單向擴(kuò)散試驗(yàn)

本試驗(yàn)是在瓊脂膠中混入一定量抗體，使待測的抗原溶液從局部向瓊脂內(nèi)自由擴(kuò)散，在一定區(qū)域內(nèi)形成可見的沉淀環(huán)。根據(jù)試驗(yàn)形成可分為試管法和平板法兩種。

（一)試管法

該方法由Oudin于1946年報道。將血清或純化抗體混入約50℃的0.7％瓊脂糖溶液中，注入小口徑試管內(nèi)，待凝固后，在凝膠中面加入抗原溶液，讓抗原自由擴(kuò)散入凝膠內(nèi)，在抗原與抗體比例恰當(dāng)位置形成沉淀環(huán)。在黑色背景斜射光處，極易觀察這種白色不透明沉淀帶。

沉淀環(huán)的數(shù)目和形態(tài)受抗原和抗體性質(zhì)的影響。溶液內(nèi)含有多種抗原，在凝膠中含有各自的抗體，擴(kuò)散后形成相應(yīng)的抗原抗體復(fù)合物，出現(xiàn)多條區(qū)帶。試管上部的沉淀帶表示抗原量少或者抗體量多；反之，下面的沉淀帶則是抗原量大，抗體量少。另外，抗體類型也有很大區(qū)別，如用兔抗血清（R型抗體)，抗體過量亦可形成復(fù)合物，因而沉淀帶寬而界線不清；如用馬抗血清（H型抗體)，抗原或抗體過量皆不形成復(fù)合物，因而只在比例合適處形成界線清晰的沉淀物（圖12-1)。

圖12-1兩種抗血清形成的沉淀帶示意圖

（二)平板法

此法由Mancini于1965年提出，是目前最常用的簡易抗原定量技術(shù)，其要點(diǎn)是：將抗體或抗血清混入0.9％瓊脂糖內(nèi)（約50℃)，未凝固前傾注成平板，凝固后在瓊脂板上打孔（一般直徑約3～5mm)，孔中加入抗原溶液，放室溫或37℃讓其向四周擴(kuò)散，24～48h后可見周圍出現(xiàn)沉淀環(huán)（圖12-2)。

圖12-2單向輻射狀免疫擴(kuò)散

上排為5個不同的參考中、下排為患者血清

下排右2為一異常病理血清

由于試驗(yàn)中抗原向四周擴(kuò)散，故又稱單向輻射狀免疫擴(kuò)散（singleradialimmunodeffusion，SRID)。最后，測量沉淀環(huán)的直徑或計算環(huán)的面積。沉淀環(huán)直徑或面積的大小與抗原量相關(guān)，但不是直線相關(guān)，而是對數(shù)關(guān)系。同時，這種沉淀zxtf.net.cn/job/還與分子量和抗散時間有關(guān)�？乖颗c環(huán)徑的關(guān)系有兩種計算方法：

1．Mancini曲線適用于大分子抗原和長時間擴(kuò)散（＞48h)的結(jié)果處理。使用方格計算紙劃線，擴(kuò)散環(huán)直徑的平方與抗原濃度呈線性關(guān)系（圖12-3)。

利用公式表示：C/d²＝K

圖12-3Mancini曲線

T₁為1624h；T₂為24～48h；T₃為48h以上；可見T₃為直線，T₁為反拋物線

式中C＝抗原濃度，d＝沉淀環(huán)直徑，K＝常數(shù)。

2．Fahey曲線這種曲線適用于小分子抗原和較短時間（24h)擴(kuò)散的結(jié)果處理。使用半對數(shù)劃線，濃度的對數(shù)與擴(kuò)散圈直徑之間呈線性關(guān)系（圖12-4)。

用公式表示：log/d＝K

式中C＝抗原濃度（mg/d)，d＝沉淀環(huán)直徑，K＝發(fā)常數(shù)。

各種蛋白質(zhì)只要符合以下3條，幾乎皆可用SRID定量測定：①備有僅對某待測抗原的單價特異抗血清；②備有已知含量的標(biāo)準(zhǔn)品；③待測品含量在1.25μg/ml以上（單向擴(kuò)散技術(shù)的敏感度)�，F(xiàn)在最常用于臨床檢測的項目有IgG、IgA、IgM、C3、C4、轉(zhuǎn)鐵蛋白、抗胰蛋白酶、糖蛋白和前白蛋白等多種血漿蛋白。

在檢測標(biāo)本的同時，用已知含量的標(biāo)準(zhǔn)抗原作5～7個稀釋度，同時測量圈的大�。ㄒ妶D12-2)。按擴(kuò)散時間（Fahey和Mancini法)的不同，取方格紙或?qū)?shù)紙做標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

單向瓊脂免疫擴(kuò)散法zxtf.net.cn/sanji/作為抗原的定量方法，其重復(fù)性和線性皆是可信賴的，唯敏感度稍差（不能測μg/ml以下含量)。另外，以下影響因素也應(yīng)注意。

1．抗血清不但要求親和力強(qiáng)、特異性好、效價高，而且還應(yīng)注意存放的方法，防止效價下降。

2．標(biāo)準(zhǔn)曲線測定必須同時制作，決不可一次做成，長期應(yīng)用。

3．測定時必須同時加測質(zhì)控血清，以保證測量準(zhǔn)確性。

4．有時出現(xiàn)擴(kuò)散圈呈兩重沉淀環(huán)的雙環(huán)現(xiàn)象。這是由于出現(xiàn)了不同擴(kuò)散率、但抗原性相同的兩個組分。例如α重鏈病血清中出現(xiàn)的α重鏈和正常IgA發(fā)生反應(yīng)，就形成內(nèi)外兩重環(huán)（圖12－2)。

圖12-4Fahey曲線

t₁為1624h；t₂為2448h；t₃為48h以上可見t₁為直線，t₃為拋物線

5．在單向擴(kuò)散試驗(yàn)時，有時會出現(xiàn)結(jié)果與真實(shí)含量不符，這主要出現(xiàn)在Ig測定中。如用單向克隆抗體或用骨髓抗原免疫動物獲得的抗血清，都存在結(jié)合價單一的現(xiàn)象，若用此作為單向擴(kuò)散試劑測量正常人的多態(tài)性抗原，則抗體相對過剩，使沉淀圈直徑變小，測量值降低。

6．測得結(jié)果的假陽性升高現(xiàn)象與上面相反，如用多克隆抗體測定單克隆病（M蛋白)，則抗原相對過剩（單一抗原決定簇成分)，致使沉淀圈呈不相關(guān)的擴(kuò)大，從而造成某一成分的偽性增加。

二、雙向擴(kuò)散試驗(yàn)

在瓊脂內(nèi)抗原和抗體各自向?qū)Ψ綌U(kuò)散，在最恰當(dāng)?shù)谋壤幮纬煽乖贵w沉淀線，觀察這種沉淀線的位置、形狀以及對比關(guān)系，可作出對抗原或抗體的定性分析。雙向擴(kuò)散也可分為試管法和平板法兩種方法。

（一)試管法

試管法由Oakley首先報道。先在試管中加入含抗體的瓊脂，凝固后在中間加一層普通瓊脂，冷卻后將抗原液體加到上層。放置后，下層的抗體和上層的抗原向中間瓊脂層內(nèi)自由擴(kuò)散，在抗原與抗體濃度比例恰當(dāng)處形成沉淀線。此法分析效果與Oudin法相似，在臨床檢驗(yàn)中罕用。

（二)平板法

平板法由Ouchterlony首先報道，是抗原抗體鑒定的最基本方法之一。該法的基本步驟是：在瓊脂板上相距3～5mm打一對孔，或者打梅花孔、雙排孔、三角孔等（圖12-5)。在相對的孔中加入抗原或抗體，置室溫或37℃18～24h后，凝膠中各自擴(kuò)散的抗原和抗體可在濃度比例適當(dāng)處形成可見的沉淀線。根據(jù)沉淀線的形態(tài)和位置等可作如下3種分析。

1．抗原或抗體的存在與否及其相對含量的估計沉淀線的形成是根據(jù)抗原抗體兩者比例所致。沉淀線如靠近抗原孔，則指示抗體含量較大；如靠近抗體孔，則指示著抗原含量較多。不出現(xiàn)沉淀線則表明抗體或抗原過剩。另外，如出現(xiàn)多條沉淀線，則說明抗原和抗體皆不是單一的成分。因此，可用于鑒定抗原或抗體的純度。

圖12-5雙擴(kuò)散各種孔型圖

2．抗原或抗體相對分子量的分析抗原或抗體在瓊脂內(nèi)自由擴(kuò)散，其速度受分子量的影響。分子量小者擴(kuò)散快，反之則較慢。由于慢者擴(kuò)散圈小，局部濃度較大，形成的沉淀線彎向分子量大的一方。如若兩者分子量相等，則形成。圖12－6顯示左側(cè)沉淀線抗原分子量大于抗體，右側(cè)沉淀線則抗體大于抗原，中間一條線則為兩者相等�？贵w多為IgG，分子量約15kD，未知抗原的分子量可做粗略估計。

圖12-6抗原抗體相對分子量示意圖

3．用于抗原性質(zhì)的分析兩種受檢抗原的性質(zhì)完全相同、部分相同或完全不同。三種情況在雙向擴(kuò)散中表現(xiàn)的基本圖形見圖12-7。

從圖12-7可以分析出，左圖中兩種受檢抗原（Ag-a)完全相同，形成一個完全融合的沉淀線；右圖中抗體為雙價，兩種抗原完全不同（Ag-a和Ag-c)；中圖的抗體為雙價，兩種抗原（Ag-ab和Ag-ac)皆有相同的a表位，又有不同的b和c表位，所以沉淀線呈部分融合的形狀。這種技術(shù)作為抗原的分析，是目前免疫化學(xué)中最常用的鑒定技術(shù)之一。