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實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸:第一節(jié) 核酸的分子結(jié)構(gòu)

一、核酸的化學(xué)組成組成核酸的元素有C、H、O、N、P等,其中N含量約為15%~16%,磷含量為9%~10%。由于核酸分子中的磷含量比較恒定,因此,核酸定量測(cè)定的經(jīng)典方法,是以測(cè)定磷含量代表核酸量。核酸經(jīng)水解可得到多核苷核,因此核苷酸是核酸的基本單位,核酸就是由很多單核…

一、核酸的化學(xué)組成

組成核酸的元素有C、H、O、N、P等,其中N含量約為15%~16%,磷含量為9%~10%。由于核酸分子中的磷含量比較恒定,因此,核酸定量測(cè)定的經(jīng)典方法,是以測(cè)定磷含量代表核酸量。

核酸經(jīng)水解可得到多核苷核,因此核苷酸是核酸的基本單位,核酸就是由很多單核苷酸聚合形成的多核苷酸,核苷酸可被水解產(chǎn)生核苷和磷酸,核苷還可進(jìn)一步水解,產(chǎn)生戊糖和含氮堿。因此,核酸是由含氮堿、戊糖及磷酸三種成分組成。

含氮堿(簡(jiǎn)稱堿基):核酸中的含氮堿簡(jiǎn)稱堿基,是嘌呤堿(purine)與嘧啶堿(pyrimidine)的衍生物。RNA和DNA含有的共同堿基成分是腺嘌呤(adeninwww.med126.come,A)、鳥嘌呤(guanine,G)和胞嘧啶(cytosine, C)。二者的區(qū)別是RNA含有尿嘧啶(uracil,U),而DNA含有胸腺嘧啶(thymine,T)。嘌呤和嘧啶都有酮-烯醇式互變異構(gòu)現(xiàn)象,一般生理pH條件下呈酮式。它們的結(jié)構(gòu)如下:

有些核酸中含有修飾堿基(或稀有堿基),這些堿基大多是在上述嘌呤或嘧啶堿的不同部位甲基化(methylation)或進(jìn)行其它的化學(xué)修飾而形成的衍生物。例如有些DNA分子中含有5-甲基胞嘧啶(m5C),5-羥甲基胞嘧啶(hm5C)。某些RNA分子中含有1-甲基腺嘌呤(m1A)、2,2-二甲基鳥嘌呤(m22G)和5,6-二氫尿嘧啶(DHU)等。

嘌呤堿和嘧啶堿一般多不易溶于水,對(duì)250~280nm波長(zhǎng)的紫外光有較強(qiáng)的吸收,但對(duì)260nm光波的吸收能力最大。由于堿基是核酸的基本組成成分,因此,所有的核酸(包括DNA和RNA)其共同特點(diǎn)是對(duì)260nm處的紫外光有最大的吸收值。

核酸分子中堿基的克分子數(shù)與磷的克原子數(shù)相等,所以可根據(jù)核酸溶液中的磷含量及紫外光的吸收值來測(cè)定核酸量。一般以每升核酸溶液中含1g磷原子為標(biāo)準(zhǔn)來計(jì)算核酸的吸光率,這稱為克原子磷吸光率或克原子磷消光系數(shù)[ε(p)],ε(p)的計(jì)算式為:

ε(p)=A/Cl

A為吸光度(光密度),1為比色杯內(nèi)徑,通常為1.0cm;C為每升核酸溶液中磷的克原子數(shù)。

C= 每升溶液中磷重(wg)/30.98ε(p)=30.98A/wl

一般DNA的ε(p)=6000~8000;RNA為7000~10000

現(xiàn)將DNA和RNA的化學(xué)組成歸納如表18-1:

表18-1

 RNADNA
嘌呤堿腺嘌呤鳥嘌呤腺嘌呤鳥嘌呤
嘧啶堿胞嘧啶尿嘧啶胞嘧啶胸腺嘧啶(或5-甲基胞嘧啶)
戊糖核糖脫氧核糖
磷酸磷酸磷酸

二、核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)

核酸又稱多核苷酸,組成DNA的脫氧核糖核苷酸主要為四種,即dAMP、dGMP、dCMP及dTMP;組成RNA的核糖核苷酸主要有AMP、GMP、CMP及UMP四種。對(duì)兩種核酸的組成可簡(jiǎn)寫如下:

DNA=(堿基-脫氧核糖-磷酸)n;RNA=(堿基-核糖-磷酸)n

核酸中核苷酸的連接方式為:一個(gè)核苷核C-3’上羥基與下一個(gè)核苷核酸C-5’連接在磷酸羥基脫水縮合成酯鍵,稱酯鍵稱3’5’磷酸二酯鍵,若干個(gè)核苷酸間依3’5’磷酸二酯鍵連接成長(zhǎng)鏈的大分子即為核酸。此長(zhǎng)鏈稱多核苷酸鏈,在鏈的一核苷酸,其C-5’連接的磷酸只一個(gè)酯鍵,稱此核苷酸為鏈的5’磷酸未端或5’。鏈的另一端核苷酸上C-3’上羥基是自由的,對(duì)此核苷酸稱為3’羥基末端或3’端,鏈內(nèi)的核苷酸在C-5’上磷酸已形成二酯鍵,C-3’上羥基也已參與二酯鍵的形成,故稱核苷酸殘基。

核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)乃指其核苷酸鏈中核苷酸的排列順序,由于核酸中核苷酸彼此之間的差別乃在于堿基部分,故核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)即指核酸分子中堿基的排列順序。

對(duì)核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的描述為:將5’磷酸末端書于左側(cè),中間部分為核苷酸殘基,3’羥基末端書于右側(cè)。通常用豎線表示核糖,堿基標(biāo)于豎線上端,豎線間有含P的斜線,代表3’,5’磷酸二酯鍵。此表示法及簡(jiǎn)化式如下:

三、核酸的高級(jí)結(jié)構(gòu)

核酸的多核苷酸鏈在次級(jí)鍵的基礎(chǔ)上,還可形成更為復(fù)雜的二級(jí)及三級(jí)的高級(jí)結(jié)構(gòu)。

(一)DNA

1.二級(jí)結(jié)構(gòu)1953年Watson 及Crick在化學(xué)分析及X光衍射法觀察DNA結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上提出了著名的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型(double helix model)此結(jié)構(gòu)是在核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上形成的更為復(fù)雜的高級(jí)結(jié)構(gòu),即DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)如圖18-1。

圖18-1 DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)

P:磷酸基;S:脫氧核糖;G:鳥嘌呤;

A:腺嘌呤;T:胸腺嘧啶C:胞嘧啶

DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)即雙螺旋結(jié)構(gòu),其內(nèi)容可歸納為:

(1)DNA分子為二條多核苷酸鏈以一共同軸為中心,盤繞成右手雙螺旋結(jié)構(gòu)。螺旋直徑2nm。螺旋盤繞形成鏈間的兩種溝,即寬的大溝與狹窄的小溝。

(2)二條多核苷酸鏈的走向相反,通常取左側(cè)鏈從上到下為5’→3’端,右則鏈從下向上為5’→3’端,這樣二條鏈構(gòu)成反平行排列的雙螺旋。

(3)二條多核苷酸鏈借氫鍵而連系在一起。氫鍵乃一鏈堿基上-NH2的氫與另一鏈上堿基的氧或氮形成。堿基有二個(gè)氫鍵,G與C之間有三個(gè)氫鍵(圖18-3)。這種相配關(guān)系稱為堿基互補(bǔ)或堿基配對(duì)。配對(duì)的堿基處于同一平面,此平面與雙螺旋的中心軸垂直,由于二條鏈中堿基互補(bǔ),所以二鏈彼此又稱為互補(bǔ)鏈。

(4)堿基對(duì)之間氫鍵的能量為3~7kcal/mol,由于氫鍵多,所以可維系DNA雙鏈結(jié)構(gòu)。另外堿基對(duì)彼此間距離為0.34nm,每一螺旋含10個(gè)堿基對(duì),故螺距為3.4nm,相鄰堿基對(duì)間彼此尚有范德瓦士(van der Waals)力作用(此力量為1~2kcal/mol,作用范圍為0.5nm),能量雖弱但由于堿基對(duì)多,合力也就大?梢妷A基對(duì)的氫鍵及堿基對(duì)之間的范德瓦士力是穩(wěn)定DNA成雙螺旋結(jié)構(gòu)的主要能量。

上述DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)是溶液及活體中常見的形式,通稱B型。當(dāng)B型所處條件的濕度低于75%時(shí),可轉(zhuǎn)變?yōu)锳型。A型的堿基對(duì)不垂直于雙zxtf.net.cn/rencai/螺旋的軸、傾斜約20度,螺距降為2.8nm,每一螺旋含11個(gè)堿基對(duì)。B型與A型的水合程度不同,它們是DNA分子在天然條件下的兩種基本形式。除A、B型外尚發(fā)出有C型雙螺旋,似B型,螺距3.3nm,第一螺旋含9個(gè)堿基對(duì)。

DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)闡明的量重要意義在于第一次提出了遺傳信息是以DNA分子中核苷酸的排列順序?yàn)閮?chǔ)存方式,從而說明了天然遺傳信息的復(fù)制過程。

2.三級(jí)結(jié)構(gòu)已發(fā)現(xiàn)線粒體、葉綠體、細(xì)菌、質(zhì)粒及一些病毒的DNA雙螺旋分子尚可形成封閉環(huán)狀,天然狀態(tài)的環(huán)狀DNA分子多扭曲成麻花狀的超螺旋結(jié)構(gòu)(superhelix),這些比螺旋更為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)即DNA分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

真核生理細(xì)胞核中的DNA具有一種超螺旋結(jié)構(gòu),即DNA雙螺旋盤繞在組蛋白上形成核小體(nucleosome)。核小體是染色質(zhì)(chromatin)的核心小粒,由有140個(gè)堿基對(duì)的雙螺旋DNA纏繞于由組蛋白(H2A、H2B、H3及H4各二分子)組成的八聚體外面,這一DNA股由此形成直徑為9nm的超螺旋1.75圈。此核小體又經(jīng)60個(gè)堿基對(duì)的DNA雙螺旋及組蛋白H1形成細(xì)絲(間隔區(qū))與下一個(gè)核小體相連接。

核小體的DNA雙螺旋為200個(gè)堿基對(duì),長(zhǎng)度應(yīng)為0.34nm×200=68nm,但實(shí)際長(zhǎng)度只10nm,說明DNA雙螺旋鏈進(jìn)一步螺旋化盤繞在組蛋白八聚體上,其長(zhǎng)度壓縮了7/8。每6個(gè)核小體又繞成一圈形成螺線管,外徑為30nm,螺距為10nm。這樣DNA分子長(zhǎng)度被壓縮了6/7。120個(gè)螺線管又盤繞成直徑為400nm,高為30nm的超螺線管,DNA分子長(zhǎng)度又被壓縮了40/41,此超螺線管即染色體的單位纖維(unit fiber),長(zhǎng)20~60nm。從單位纖維形成染色單體(chromatid),實(shí)際長(zhǎng)度為2~10nm,DNA分子長(zhǎng)度又被壓縮了5/6~6/7。這樣從許多核小體組成的串珠樣纖維經(jīng)多層次螺旋化結(jié)構(gòu)到形成染色單體,DNA分子的長(zhǎng)度已被壓縮至近1/10000。

(二)RNA

RNA分子也是由核苷酸依3’,5’磷酸二酯鍵形成的多核苷酸鏈。RNA總是以單鏈的形式存在,也有5’磷末端及3’羥基末端。RNA單鏈的局部折疊成的某一片段的A及G分別與另一片段的U及C配對(duì)常形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)(hairpin structure)。在此結(jié)構(gòu)內(nèi)的堿基無需全部配對(duì),而配對(duì)部位形成小的雙螺旋區(qū)域,不能配對(duì)的堿基則連成小環(huán)從螺旋區(qū)中被圈出來。這種RNA單鏈局部小雙螺旋結(jié)構(gòu)即是RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

四、基本組織

由于DNA分子中核苷酸序列分析以及一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能相關(guān)的研究,使得人們有可能進(jìn)一步了解DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)與基因組織的關(guān)系。已經(jīng)證實(shí),自然界極大多數(shù)生物體遺傳信息貯存在DNA的核苷酸排列順序中,因此,基因是DNA的一個(gè)片段,只有少數(shù)病毒的遺傳信息貯存在RNA分子中。DNA分子中不同區(qū)域有不同功能,有些區(qū)域可編碼蛋白質(zhì)(最終產(chǎn)物是蛋白質(zhì)),有些區(qū)域可編碼RNA(最終產(chǎn)物是tRNA和rRNA),有些序列則與調(diào)控有關(guān)。那么一個(gè)DNA分子能攜帶多少基因呢?如果以平均1000個(gè)堿基對(duì)可編碼一個(gè)3kD的蛋白質(zhì)計(jì)算,猴病毒(SV40)DNA分子量為3.0×105,有5000堿基對(duì)可編碼5種蛋白質(zhì)。人染色體DNA有2.3×109堿基對(duì),可編碼200萬以上的基因,但實(shí)際上,最多可編碼基因數(shù)為2~3萬。這是由于真核細(xì)胞DNA分子除編碼蛋白質(zhì)和RNA等結(jié)構(gòu)基因外,有相當(dāng)部分DNA順序?qū)儆诜蔷幋a區(qū),而原核細(xì)胞DNA由于分子較小,必需充分利用有限的核苷酸序列。各種生物體內(nèi)DNA分子的大小見表18-2。

表18-2 各種生物體內(nèi)DNA分子的大小

來源分子量堿基對(duì)數(shù)目長(zhǎng)度
噬菌體фX174  0.6μm
腺病毒(SV40)1.6×10645001.5μm
鼠線粒體3.0×106140004.9μm
噬菌體λ9.5×1065000017μm
噬菌體T2或T43.3×10720000067μm
大腸桿菌染色體1.3×10845000001.5μm
人染色體3.0×1091250000004.1μm

1.真核生物的基因組織根據(jù)某一段核苷酸順序在整個(gè)DNA分子中出現(xiàn)的頻率不同可分為以下幾種:

(1)單拷貝順序(singlecopy sequence):在整個(gè)DNA分子中只出現(xiàn)一次或少數(shù)幾次,主要是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。除組蛋白、角蛋白和肌動(dòng)蛋白以外,幾乎所有的蛋白質(zhì)基因都是單拷貝順序,平均為1000堿基對(duì)。單拷貝基因在整個(gè)基因組織中所占比例最高。在人的細(xì)胞中約占DNA含量的一半。

(2)中等重復(fù)順序(moderatelyrepetitive sequences):有些基因如核蛋白體RNA基因、tRNA基因、組蛋白基因等在DNA分子中可重復(fù)出現(xiàn)幾十到幾千次,約占人細(xì)胞DNA含量的30~40%。以rRNA為例,在大腸桿菌中重復(fù)頻率為7而果蠅中可重復(fù)千次?梢娬婧思(xì)胞中重復(fù)順序比原核細(xì)胞高得多。

(3)高重復(fù)順序(highlyrepetitive sequences):可重復(fù)幾百萬次。往往是簡(jiǎn)單的重復(fù)順序,如的T-A-T-A-T-A-T。也有的較長(zhǎng)如非洲綠猴DNA是以172個(gè)堿基對(duì)的順序?yàn)榛A(chǔ)重復(fù)幾萬次。高重復(fù)順序一般位于異染色質(zhì)上,多數(shù)不編碼蛋白質(zhì)或RNA,其功能還不太清楚,主要是起間隔作用,可能與調(diào)控有關(guān)。

在重復(fù)順序中還有一種反轉(zhuǎn)重復(fù)順序(inverted repetitivesequences)。其特點(diǎn)是一段堿基呈現(xiàn)回文結(jié)構(gòu),即一條單鏈回折即可形成互補(bǔ)的雙鏈,故稱為回文結(jié)構(gòu)(palindromicstructure)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)(hairpin structure)。這種結(jié)構(gòu)對(duì)基因的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄可能具有調(diào)節(jié) 控制功能。

真核細(xì)胞中單拷貝順序和重復(fù)順序常常是中間隔排列的。不僅如此,在一個(gè)基因內(nèi)部往往被一個(gè)或幾個(gè)額外的順序分割成若干片段,這種插入到基因內(nèi)部的順序稱為插入順序或內(nèi)含子(intron)。內(nèi)含子是不編碼的順序,而編碼的堿基順序則稱為外顯子(exon)。插入順序是真核細(xì)胞DNA最主要的特征。

真核生物由于存在著較多的重復(fù)順序、特殊的插入順序以及控制區(qū)和其它多余順序,使得DNA總長(zhǎng)度往往大于編碼的結(jié)構(gòu)基因,因此,實(shí)際基因數(shù)往往小于DNA分子。

2.原核生物的基因組織原核生物DNA分子較小,基因組織也較簡(jiǎn)單,一般具有以下特點(diǎn):

(1)DNA分子絕大部分用于編碼蛋白質(zhì),不編碼部分(又稱間隔區(qū))通常包含控制基因表達(dá)的順序。例如,噬菌體фX174中只有5%是非編碼區(qū)。

(2)功能相關(guān)的基因常常串聯(lián)在一起,并轉(zhuǎn)錄在同一個(gè)mRNA分子中,稱為多順序反子。這種現(xiàn)象在真核生物中是很少見的。

(3)基因重疊:例如фX174的E基因全部包括在D基因內(nèi),B基因則包括在查基因內(nèi)。這種現(xiàn)象主要發(fā)現(xiàn)在病理DNA分子中,可能是由于DNA分子太小又要裝入相當(dāng)量的基因的緣故。

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