近年，不少科技工作者將原位雜交組織細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（ISHH)應(yīng)用于細(xì)胞分裂中期（Metaphase)和分裂間期（Interphase)的染色體鋪片上，利用標(biāo)記的核苷酸探針與之進(jìn)行雜交，可在光鏡或電鏡水平檢測到不同的特異性的標(biāo)記物。目前，原位雜交組織化學(xué)在染色體鋪片的應(yīng)用主要在三個方面：染色體的基因分配或基因圖（Gene assignment)的研究、癌細(xì)胞或癌前組織的染色體異常的間期細(xì)胞遺傳學(xué)分析研究和性染色體對胚胎的生前診斷。在依次介紹這些方法的應(yīng)用以前，我們先簡要介紹一個有關(guān)染色體的基本的知識和染色體鋪片的制作方法。
體細(xì)胞的染色體是46個，23個，其中22對是常染色體，一對是性染色體。男性一對XY，女性為XX。染色體的形態(tài)隨著細(xì)胞周期的不同而有所改變，在光學(xué)顯微鏡下所看到的染色體是細(xì)胞分裂中期染色體（metaphase chromsome)。
每個染色體含有兩條染色單體，呈赤道狀彼此分離，只有著絲粒處相連。根據(jù)著絲粒的位置分為三種類型，中部著絲粒型，亞中部著絲粒和端著絲粒型（圖21-1)。
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圖21-1 正常人體細(xì)胞的三種染色體
1．中部著絲點染色體；2.近中部著絲點染色體；3.www.med126.com近端部著絲點染色體
1.非顯帶染色體特征分為七組
A組（1～3)：為最大的具中部著絲粒染色體，這組染色體相互間很易區(qū)別。第1號和第2號染色體大小相似，唯第2號染色體為近中部著絲粒染色法。第3號染色體較1、2號染色體小，為中部著絲粒染色體。
B組（4～5)：為大的具中部著絲粒染色體。2對染色體之間在形態(tài)和長度上較難區(qū)別。
C組（6～12號和X)：為中等大小的具中部或近中部著絲粒染色體。這組染色體較難區(qū)分，其中第6、7、11號和X染色體為中部著絲粒染色體，第8、9、10和12號染色體為近中部著絲粒染色體。女性為2個X染色體。男性只有1個X染色體。
D組（13～15號)：為zxtf.net.cn/Article/中等大小的具近端著絲粒染色體。在其短臂上有隨體。與他組染色體有明顯區(qū)別。但3對染色體之間較難區(qū)別。
E組（16～18號)：為小的具中部或近中部著絲粒染色體。第16號染色體為中部著絲粒染色體，第17號和18號染色體為近中部著絲粒染色體。不過，著絲粒位置第18號較第17號染色體更近端部。
F組（19～20號)：為更小的中部著絲粒染色體。2對染色體之間，形態(tài)上很難區(qū)別。
G組（21～22號和Y)：為最小的近端著絲粒染色體。第21號和22號染色體大小相似，且短臂上常連有隨體。Y染色體常比第21和22號染色體大、染色深。且無隨體。Y染色體長臂2個染色單體比較靠攏，長臂末端也較模糊。
2．G帶染色體的特征
第1號染色體：識別并不困難，但初學(xué)者易把長短臂顛倒。短臂的近側(cè)1/2處有2個深帶。遠(yuǎn)側(cè)有一半幾乎為淺染區(qū)；短臂共分3區(qū)。界標(biāo)為近側(cè)的深帶（2區(qū)1帶)和中段的深帶（3區(qū)1帶)。長臂近側(cè)為一窄的淺帶。中段和遠(yuǎn)側(cè)段各有2條深帶；長臂共分4區(qū)，界標(biāo)為次縊痕遠(yuǎn)側(cè)的淺帶（2區(qū)1帶)、中段的深帶（3區(qū)1帶)和遠(yuǎn)側(cè)的深帶（4區(qū)1帶)。
第2號染色體：短臂可見4條深帶。中段的2條深帶常互相靠近，表現(xiàn)為1條深帶；短臂共分2區(qū)，界標(biāo)為1淺帶（2區(qū)1帶)。長臂可見4～7帶，近側(cè)著色甚淺，中段及遠(yuǎn)側(cè)著色較深；長臂共分3區(qū)，界標(biāo)為2個淺帶（2區(qū)1帶和3區(qū)1帶)。
第3號染色體：短臂近側(cè)可見2條深帶；遠(yuǎn)側(cè)可見3條深帶，其中遠(yuǎn)端的1條帶較窄，染色淺；短臂分為2區(qū)，界標(biāo)為1淺帶（2區(qū)1帶)，長臂近側(cè)和遠(yuǎn)側(cè)各有1條較寬的深帶：好的標(biāo)本近側(cè)深帶可分為2條深帶，遠(yuǎn)側(cè)深帶可分為3～4條深帶；長臂分為2區(qū)，界標(biāo)為1淺帶（2區(qū)1帶)。長臂深帶寬度略大于短臂深帶。
第4號染色體：短臂有1～2條深帶，只1區(qū)。長臂有均勻分布的4條深帶；長臂分3區(qū)；界標(biāo)為2淺帶（2區(qū)1帶和3區(qū)1帶)。
第5號染色體：短臂有1條深帶，只1區(qū)。長臂有5條深帶，中段的3條深帶�？拷�；長臂分3區(qū)，界標(biāo)有1深帶（2區(qū)1帶)和1淺帶（3區(qū)1帶)。
第6號染色體：短臂近側(cè)有1寬的淺帶，遠(yuǎn)側(cè)為1深帶；短臂分2區(qū)，界標(biāo)為1淺帶（2區(qū)1帶)。
第7號染色體：短臂有2～3條深帶，近末端帶著色很深；短臂分2區(qū)，界標(biāo)為1深帶（2區(qū)1帶)長臂有3條深帶，近側(cè)和中部的2條帶較深；長臂分3區(qū)，界標(biāo)為2深帶（2區(qū)1帶和3區(qū)1帶)。
第8號染色體：短臂有2條深帶，遠(yuǎn)側(cè)深帶較近側(cè)深帶著色深；短臂分2區(qū)，界標(biāo)為1淺帶（2區(qū)1帶)。長臂有3～4條深帶，遠(yuǎn)中的深帶著色較深；長臂分2區(qū)，界標(biāo)為1深帶（2區(qū)1帶)。
第9號染色體：短臂有1～2條深帶；短臂分2區(qū)，界標(biāo)為1深帶（2區(qū)1帶)。長臂2條深帶。長臂分3區(qū)，界標(biāo)為2深帶（2區(qū)1帶和3區(qū)1帶)。
第10號染色體：短臂有2條深帶，近側(cè)較近側(cè)深帶著色淺；短臂只1區(qū)。長臂有3條深帶，近側(cè)深帶著色更深；長臂分2區(qū)，界標(biāo)為1深帶（2區(qū)1帶)。
第11號染色體：短臂有1～2條深帶；短臂只1區(qū)。長臂有2條深帶，在近側(cè)深帶與著絲粒之間有1寬的淺帶；長臂為2區(qū)，界標(biāo)為1淺帶（2區(qū)1帶)。
第12號染色體：短臂有1條深帶；短臂只1區(qū)。長臂有3條深帶，中間的1條深帶寬，近側(cè)深帶與著絲粒的距離較第11號染色體近；長臂分2區(qū)，界標(biāo)為1深帶（2區(qū)1帶)。
第13號染色體：長臂有4條深帶，中間2條深帶寬；長臂分3區(qū)，界標(biāo)為中間的2條深帶（2區(qū)1帶及3區(qū)1帶)。
第14號染色體：長臂有45條深帶，近側(cè)的第2條帶和遠(yuǎn)側(cè)的帶著色更深；長臂分3區(qū)，界標(biāo)為2條深帶（2區(qū)1帶和3區(qū)1帶)。
第15號染色體：長臂有4條深帶，近側(cè)的第2條帶較寬；長臂分2區(qū)，界標(biāo)為1深帶（2區(qū)1帶)。
第16號染色體：短臂有1～2條深帶，短臂只1區(qū)。長臂有2條深帶，近中部深帶明顯；長臂分2區(qū)，界標(biāo)為1深帶（2區(qū)1帶)。
第17號染色體：短臂有1深帶；只1區(qū)。長臂1～2深帶，遠(yuǎn)側(cè)深帶較寬，在深帶與著絲粒之間有1寬的淺帶；分2區(qū)，界標(biāo)為淺帶（2區(qū)1帶)。
第18號染色體：短臂為1淺帶區(qū)。長臂有2條深帶；為2區(qū)，界標(biāo)是1淺帶（2區(qū)1帶)。
第19號染色體：著色最淺。著絲粒周圍為深帶。短臂和長臂均為1區(qū)。
第20號染色體：短臂有1深帶，較寬；短臂和長臂均為1區(qū)。長臂有1深帶，較寬。
第21號染色體：最小的1個染色體。長臂緊按著絲粒處有1深帶，較寬；長臂為2區(qū)，界標(biāo)為1深帶（2區(qū)1帶)。
第22號染色體：較21號色體長，長臂緊接著絲粒處有1深帶，較窄。短臂和長臂均為1區(qū)。
X染色體：短臂中部有1條深帶；分2區(qū)，界標(biāo)是深帶（2區(qū)1帶)。長臂有4條深帶，其中近槽深帶最寬；分2區(qū)，界標(biāo)是近側(cè)深帶（2區(qū)1帶)。
Y染色體：長臂遠(yuǎn)側(cè)半色著深，為1深帶；短臂和長臂均為1區(qū)。
現(xiàn)在國內(nèi)流行一種辨認(rèn)G帶每個染色體的口訣，稍加修改如下：
一禿二蛇三蝶飄，四象鞭炮五黑腰；
六號短空小白臉，七上八下九苗條；
十號長臂近帶好，十一低來十二高；
十三十四十五號，三個長臂一二一；
十六長臂縊痕大，十七長臂帶腳鐐；
十八人小肚皮大，十九中間一黑腰；
二十頭重腳腳底輕，二十一帶寬身體�。�
二十二帶小身體大，Y長一寬近末端；
X短臂一、長臂三，中間象個工字般。
1．原理染色體的化學(xué)成份是核酸和蛋白質(zhì)兩部分。核酸以DNA為主，蛋白質(zhì)有組蛋白和非組蛋白兩種。因此染色體經(jīng)蛋白水解酶類物質(zhì)處理后，蛋白質(zhì)已被水解而使DNA分子中堿基暴露，由于堿基中G/C和A/T組合的比例不同，對染料結(jié)合的程度不一，如這一段A/T堿基的成份多，則Giemsa染料易與它結(jié)合成深染；另一段G/C堿基的成份多，則Giemsa染料不易與其結(jié)合，結(jié)果成淡染，由于整條染色體上A/T和G/C的分布不勻，這樣在染色體上呈現(xiàn)出深淺不一的條紋或者稱帶紋，該技術(shù)用Giemsa染色，故其帶型稱為G帶。
2．操作過程
（1)按常規(guī)染色體技術(shù)制片。
（2)制好的染色體玻片，在80℃烘箱中，烘烤2h，置于室溫。
（3)4℃冰箱PBS液5min。
（4)4℃冰箱PBS緩沖液含胰蛋白酶終濃度0.025%，消化10min。
（5)蒸餾水洗凈胰酶。
（6)Giemsa染色20min。
（7)蒸餾水洗凈染色液，晾干鏡檢。
4℃低溫胰酶處理片子，其優(yōu)點是：時間較長，易掌握。配制1次試劑可用1～2個月。
1．原理常規(guī)的G帶顯帶技術(shù)，在人類染色體中僅觀察到320～450條帶紋，對于一些染色體細(xì)微結(jié)構(gòu)異常的識別是不夠的。
氨甲碟呤抑制二氫葉酸還原酶，阻止葉酸轉(zhuǎn)變?yōu)樗臍淙~酸，從而干擾了脫氧胸腺嘧啶核苷酸的合成，阻止了DNA的復(fù)制，使細(xì)胞被阻止在S期內(nèi)。胸腺嘧啶核苷解除氨甲喋呤的作用，讓被阻滯的細(xì)胞同時開始進(jìn)行DNA復(fù)制，進(jìn)而同步分裂；放線菌素D可增加染色體的長度，能顯示更多的亞帶。放線菌素D與核酸相互作用：①插入脫氧鳥嘌呤核苷酸和脫氧胞啶核苷酸之間，使DNA變長；②能與染色體縮短有關(guān)的特殊蛋白和DNA結(jié)合，因此，抑制了染色體正常的收縮過程。秋水仙胺抑制紡垂絲的形成，可以得到較多的晚前期、前中期、早中期的分裂相。這樣染色體帶紋可增加到500和850條，甚至可達(dá)1200～2000條之多。這一步對于研究較細(xì)小的染色體缺陷的基因定位，具有很大的意義。
2．材料和方法
（1)4ml培養(yǎng)液（為從日本進(jìn)口的RPMi 1640或從美國進(jìn)口的F10液)雖自制的小牛血清1ml。每ml加青、鏈霉素各100單位，pH=7.2。
（2)每瓶培養(yǎng)液內(nèi)，另加自制的PHA或重慶產(chǎn)的PHA2.5mg。
（3)取外周血2ml，分別裝入含培養(yǎng)液的4個培養(yǎng)瓶內(nèi)。
（4)37℃孵育箱內(nèi)培養(yǎng)72h。
（5)加入氨甲喋呤，最終濃度10-7mol/L，繼續(xù)培養(yǎng)17h。
（6)用不含血清的培養(yǎng)液沖洗兩次后，將上清液吸出，再加入含胸腺嘧啶核苷（最終濃度為10-5mol/L)的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3h。
（7)再加入放線菌素D，最終濃度為3μg/ml，培養(yǎng)2h。
（8)加秋水仙胺，最終濃度為0.03μg/ml，培養(yǎng)2h。
（9)按常規(guī)染色體技術(shù)制片。
（10)按一般常用的G帶顯帶技術(shù)，顯示帶紋。
3．注意事項
（1)高分辨染色體，重疊多，應(yīng)增加固定次數(shù)和固定時間，可置于4℃冰箱存放24h后制片，用高距離滴片，以使染色體分散開。
（2)細(xì)胞培養(yǎng)液同步化后，如果用5-溴-2脫氧尿核苷（5-bromodeoxyuridine,BrdU)，則需加黑物包裝進(jìn)行暗培養(yǎng)。
1．國內(nèi)應(yīng)用的外周血培養(yǎng)染色體技術(shù)
（1)原理：外周血染色體制備是目前應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞遺傳學(xué)診斷技術(shù)，亦是基本的實驗技術(shù)，由于取材容易，培養(yǎng)過程比較簡單，短期內(nèi)可以得到結(jié)果，所以其實用價值很高。
血液中含有紅、白兩類細(xì)胞，它們均是處于未分裂的間期細(xì)胞。紅細(xì)胞沒有核，無分裂能力；白細(xì)胞類雖有細(xì)胞核存在，但是外周血中處于休止期。植物血球凝集素（簡稱PHA)能促使淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有分裂作用的母細(xì)胞。染色體只有在細(xì)胞分裂中期時最典型。秋水仙素類藥的藥物能抑制紡錘絲的形成，使細(xì)胞分裂停止于中期，低滲處理使細(xì)胞膨脹，細(xì)胞膜破裂，染色體分散，這樣就可便于分析。
簡意流程圖：
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（2)操作過程
①采血：無菌干針筒從靜脈取血1～2ml，用肝素抗凝（約每毫升全血內(nèi)含肝素100單位)。
②培養(yǎng)液配制：RPMI 1640 4ml
小牛血清 1ml
1%PHA（自制)0.2ml
調(diào)節(jié) pH為7.4后置于-20℃冰箱
③標(biāo)本接種：每5ml培養(yǎng)液加入抗凝全血0.5ml。
④培養(yǎng)細(xì)胞：將接種好的培養(yǎng)瓶置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)72h。
⑤阻止分裂：培養(yǎng)至68h，加秋水仙素，最終濃度0.02μl/ml，搖勻后置于37℃恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。
⑥收獲：培養(yǎng)物混合后，置于10ml離心管內(nèi)，離心10min（1000轉(zhuǎn)/min)，去上清液。留下培養(yǎng)物。
⑦低滲處理：低滲液可用0.56%的KCl（或0.075mol/l KCl)5～7ml，用吸管打散沉淀物，置于37℃水浴箱中保溫20min，然后加入固定液（3份甲醇：1份冰乙酸)1ml用吸管打勻，預(yù)固定1～2min。
⑧離心：1000轉(zhuǎn)/min離心10min。
⑨固定：吸去上清液，留下沉淀加上述固定液6～8ml，用吸管將沉淀物打散，固定30min后離心，1000轉(zhuǎn)/min離心10min，取出吸去上清液留下沉淀。
⑩重復(fù)上述固定離心1次。
⑾標(biāo)本制作：最后1次固定、離心后吸去上清液，留下沉淀再加少量新鮮固定液約0.3ml打散細(xì)胞懸浮液即可進(jìn)行制片。制片之前先將載玻片經(jīng)清潔液洗凈處理后，置于冰箱內(nèi)制成冰片。取冰片1張滴上2～3滴細(xì)胞懸液。利用冰片的表面張力關(guān)系使液體迅速向玻片四周散開，與此同時用嘴輕輕吹向滴片處，以助其更快散開，然后在酒精燈火上通過7～8次后，自然干燥或烤干均可。
⑿染色：Giemsa染液1份和pH7.4磷酸緩沖液9份，混合后，染色20min，蒸餾水洗去余下染液，晾干，鏡檢觀察。
（3)注意事項
①無菌操作是關(guān)鍵。培養(yǎng)液不得污染。
②所用藥品不得失效，特別是PHA，既要使淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，又不能過量。
③小牛血清優(yōu)質(zhì)、無菌。
④秋水仙清素低濃度4～6h效果最佳，過量則染色體易收縮。
⑤固定液和Giemsa染液要求新鮮配用。
⑥培養(yǎng)時間72h較好。
（4)各種物品清洗與消毒
①玻璃器皿用后，立即用自來水沖洗，再用洗衣粉刷洗，然后用自來水沖洗。待干，泡入清潔液24～48h，取出，自來水沖洗，再用雙蒸水沖洗，干后備用。
②接觸洗液時，帶上橡皮手套，圍裙等防護(hù)品。
常用清潔液配制：
重鉻酸鉀25g
水200ml
濃硫酸1000ml
③先將重鉻酸鉀在水中溶解，然后慢慢加入濃硫酸，邊加邊攪拌，防止過度發(fā)熱。使用3～6月后檢查，若變綠表示失效。
④G5、G6漏斗的處理：水洗凈、晾干，于濃硫酸泡（或洗液中泡)24h，再用蒸餾水沖洗至加入1%BaCl2滴無白色沉淀為止。包裝消毒，15磅20min。
（5)橡皮塞的處理
新的橡皮塞洗后，先用0.5N NaOH煮沸15min，再用0.5n HCl煮沸15min，流水沖洗10min，用雙蒸水泡24h，雙蒸水沖洗，晾干，15磅20min高壓滅菌。
（6)金屬器械清洗
先用紗布或紙擦去防銹油，然后用洗滌液清洗，再用清水或蒸餾水洗凈，擦干或烘干備用。
2．外周血細(xì)胞培養(yǎng)法（Bhatt B and McGee JOD,1990)
（1)收集靜脈血（無菌)，加肝素抗凝（20單位/ml)；
（2)加0.8ml全血入每個培養(yǎng)瓶（含10ml培養(yǎng)液)，37℃培養(yǎng)72h；
培養(yǎng)液配制：RPMI 76ml(Gibco,Cat.No.041-1875M)
小牛血清 20ml
PHA 2.0ml
（3)加100μl Brdu于培養(yǎng)瓶中，37℃再孵育16～17h；
（4)離心（1200rpm)8min，棄去上清液，沉淀中加入10ml RPMI 1640培養(yǎng)液，混勻；
（5)重復(fù)步驟（4)；
（6)沉淀中加入10ml新配制的完全培養(yǎng)液（含2.5μg/ml胸腺嘧啶)，重新置于37℃孵育6～7h；
（7)在收獲培養(yǎng)細(xì)胞前15～30min，可加Colcemid,但當(dāng)同時應(yīng)用BrdU時這就并非十分必要。因為BrdU是胸腺嘧啶核苷的類似物，能使染色體在富含異染色質(zhì)處斷裂分解，從而使顯帶明顯；
（8)1200rpm離心培養(yǎng)細(xì)胞，棄去上清液，加入1ml 0.56% KCl（事先預(yù)熱至37℃)，繼續(xù)加入0.56%KCl使總?cè)萘窟_(dá)到10ml，在37℃孵育10min；
（9)如上述離心，棄去上清液，在沉淀的細(xì)胞內(nèi)加入新鮮的冷固定劑，（甲醇：冰醋酸=3：1，新鮮配制，保存在冰上)，置冰上至少20min；
（10)重復(fù)步驟（9)3～4次，直至細(xì)胞懸液清潔無色；
（11)可較長期保存在冰的固定劑內(nèi)（-20℃)或再離心后加入0.5～1.0ml新鮮固定劑，置于冰上；
（12)玻璃載片放在Decon（清潔液)或其它的清潔液內(nèi)過夜，次日用自來水沖洗，繼之蒸餾水漂洗，在60～75℃干燥，然后把載片孵育在2%丙酮液內(nèi)，室溫，60min。自來水沖洗，再在60～75℃干燥；
（13)每張載片上加10μl的細(xì)胞混懸液，空氣干燥，在24h后可應(yīng)用于雜交實驗，也可保存在-4℃達(dá)8周之久（試劑配制法見附錄四)。
（一)基本原理
染色體上基因位置分配的研究，又叫染色體圖的研究，包括基因名稱、基因在染色體的位置及與相鄰基因的距離及其核酸序列的研究。研究基因圖的方法包括家系的連鎖分析法、體細(xì)胞雜交法、重組DNA技術(shù)和原位雜交法。果蠅的線形基因圖和大腸桿菌、T4噬菌體兩者的環(huán)狀基因圖都已繪成，目前正致力于人類基因圖的繪制。人類基因約有5萬～10萬個，根據(jù)第八次國際人類基因定位工作會議，已定位的人類基因總數(shù)達(dá)1479個。
ISHH技術(shù)對染色體基因圖的研究，是用同位素或生物素、地高辛標(biāo)記的核酸探針，直接同中期的染色體鋪片行雜交。早期的研究是用于重復(fù)序列DNA的定位，如編碼核糖體的基因18S和28S核糖體RNA定位于第13～15號染色體和第21～22號染色體短臂次縊痕區(qū)。5S核糖體RNA定位于第1號染色體上長臂的遠(yuǎn)側(cè)Iq42～I(xiàn)q43。近年已能進(jìn)行單拷貝基因的定位，如胰島素基因定位于IIp 15上、C-mos原癌基因定位于Sq22上、N-ras原癌基因定位于IPI34。在染色體11的短臂上，利用ISHH技術(shù)證明4個基因依次排列，從短臂的遠(yuǎn)端依次為胰島素、β-球蛋白、HRASI和PTH。
（二)操作步驟（Bhatt and MCGee, 1990)
在前面已介紹了制備血培養(yǎng)染色體鋪片的方法。下面介紹的是在染色體制片上用免疫金銀染色法進(jìn)行原位雜交的基因定位顯示、結(jié)合Giemsa染色顯帶技術(shù)的操作步驟。
1．移除內(nèi)源性RNA
（1)加100μl RNA酶溶液，覆以蓋玻片，放在有少許2×SSC溶液的濕盒內(nèi)孵育，37℃，60min。
（2)在2×SSC溶液內(nèi)移除蓋玻片，以2×SSC洗2×3min。
（3)等級酒精系列脫水，10%，50%，70%，90%和100%，各1min，各1min�？諝飧稍�。
2．探針標(biāo)記和純化用缺口平移法將生物素11-dUTP標(biāo)記在DNA核酸探針上。
3．變性與雜交
加20～100ng生物素標(biāo)記探針到雜交液中，加入5μl 20mg/ml人或鯡魚精子DNA，總?cè)萘繛?0～40μl，離心5s，混勻后，滴于染色體鋪片，覆以蓋玻片，蓋片四周以橡皮泥封固。放入盛2×SSC溶液溫盒內(nèi)75℃7～8min，使之變性，繼之于37℃孵育16h。
4．雜交后漂洗2×SSC溶液內(nèi)移除蓋玻片，將載片浸入含50%甲酰胺的2×SSC溶液內(nèi)，pH7.2,20min,42℃。然后作下列程序漂洗
溶液 漂洗時間溫度
2×SSc 20min42℃
1×SSC20min 室溫
0.1×SSc 20min 室溫
5．免疫細(xì)胞化學(xué)顯示
（1)孵育載片于PBt 15min，將片緣及背面擦干，加100μl一抗于載片（兔抗生物素抗血清1：100，以PBT稀釋)，孵育于37℃40～60min。
（2)快速用PBT沖洗，擦干片緣及背面，加100μl二抗抗血清（羊抗兔IgG結(jié)合10～20nm金粒，以PBT1：50稀釋)于載片染色體鋪片部位，37℃孵育45～60min。
（3)PBS洗3×5min。
（4)蒸餾水洗3×5min。
（5)加數(shù)滴銀溶液于載片上，在光鏡下監(jiān)測，大約需5～18min可見在染色體上出現(xiàn)銀斑點。
（6)蒸餾水洗。PBT配制見附錄3。
6．顯帶復(fù)制（Replication banding)
（1)應(yīng)用5μg/ml Hoechst 33258在2×SSC溶液內(nèi)，暗室中染載片20min。
（2)蒸餾水洗，以2×SSC封固，覆以蓋玻片，蓋片四周封以橡皮泥。
（3)紫外光照射1～16h。
（4)蒸餾水洗和以10%Giemsa（磷酸緩沖液稀釋，pH6.8～7.2)染色10min。
（5)蒸餾水沖洗，空氣干燥，以DPX封固。
（6)光鏡下觀察，可見棕色的銀斑點在染色體上的定位，并顯示其與染色體分帶的關(guān)系。
（一)基本原理
在惡性的或癌前病變的組織，染色體組含量與結(jié)構(gòu)的畸變在部分病例中與疾病的預(yù)后相一致。由于染色體基因的變化可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展，利用一些技術(shù)預(yù)測這些遺傳物質(zhì)的變化可為惡性腫瘤的檢測及了解其進(jìn)展和預(yù)后提供資料。流式細(xì)胞計（FCM)和染色體組型，即核型分析（karyothping analyses)等技術(shù)曾被用于這個領(lǐng)域的研究。FCM可測定腫瘤細(xì)胞DNA的含量，但它不能顯示特異性染色體的結(jié)構(gòu)異常，而且對微量的DNA含量改變難以檢測。核型分析可以顯示染色體結(jié)構(gòu)和含量的變化，但要分析腫瘤細(xì)胞的核型只有在細(xì)胞培養(yǎng)以后。細(xì)胞培養(yǎng)時細(xì)胞的高度分裂指數(shù)和細(xì)胞的生長會導(dǎo)致染色體物質(zhì)的丟失，而且核型分析不能顯示特異性DNA探針的原位雜交技術(shù)，能夠檢測在細(xì)胞分裂間期細(xì)胞核內(nèi)染色體數(shù)量和結(jié)構(gòu)的異常變化。因此，這項技術(shù)又被稱為“間期細(xì)胞遺傳學(xué)分析法（Interphase Cytogenetics Analysis, ICA)。間期細(xì)胞遺傳學(xué)的基本原理是利用合成的特異性DNA探針，標(biāo)記以同位素、生物素、地高辛或熒光素，對外周血、腫瘤細(xì)胞或癌前組織的離散培養(yǎng)細(xì)胞的染色體鋪片或切片進(jìn)行DNA-DNA原位雜交，其雜交定位以熒光法、放射自顯影或免疫組化法顯示。目前ICA已廣泛應(yīng)用于生前診斷、腫瘤組織活檢材料的診斷和基因異常的診斷。在腫瘤細(xì)胞方面，在乳腺癌，神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、睪丸腫瘤，婦科腫瘤和膀胱腫瘤等均有實驗報告。現(xiàn)已能提供的DNA探針有染色體1，7，8，9，10，15，16，17，18和性染色體X、Y，以及識別一些染色體特征性部位如著絲點（centromeric region)、染色體端極區(qū)（telomere region)的特異性重復(fù)靶核苷序列和隨體的DNA探針，多數(shù)為合成的寡核苷酸探針，在應(yīng)用上采取ISHH和FCM以及免疫組化相結(jié)合（有時還結(jié)合核型分析)的綜合研究法（圖21-2)，也可用多種標(biāo)記物顯示不同顏色或不同標(biāo)記在一張切片上同時顯示多個染色體的結(jié)構(gòu)或DNA含量異常，如異硫氰酸熒光素（FITC)和羅丹明200結(jié)合，前者顯示黃綠色，后者顯示紅色，ABC-DAB顯示法與地高辛-堿性磷酸酶系統(tǒng)相結(jié)合，前者反應(yīng)物為棕色，后者為紫藍(lán)色。這種聯(lián)合應(yīng)用法又叫多靶點原位雜交法（multiple-target ISH)。
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圖21-2 腫瘤組織處理流程圖
（二)基本操作方法
1．玻片與組織前處理
（1)腫瘤細(xì)胞混懸液的制備：新鮮的從活檢或外科手術(shù)或尸檢獲得的材料建議按圖21-2的流程處理進(jìn)行綜合研究。用以制作細(xì)胞混懸液的組織在處理前可保存于液氮內(nèi)。組織塊在玻皿中切碎或用細(xì)胞打碎機打碎，用100μm孔直徑的尼龍網(wǎng)過濾器濾過，固定在70%乙醇，-20℃，如保存于-39℃可保存數(shù)月至數(shù)年。
（2)分離的細(xì)胞由于表面有細(xì)胞質(zhì)的覆蓋，在熒光顯微鏡下會顯示強烈的自動熒光，從而掩蓋了ISHH的信號�？刹扇∠铝袃煞N方法移除覆蓋的細(xì)胞質(zhì)；
①乙醇固定后的細(xì)胞，應(yīng)用以前在新鮮制備的甲醇/醋酸（3：1)固定液內(nèi)0℃，5min。滴2～3滴固定后的細(xì)胞混懸液于涂有粘附劑的載片上，空氣干燥，然后快速浸入70%醋酸內(nèi)10～60s。應(yīng)用蒸餾水洗，在100%乙醇內(nèi)脫水，空氣干燥。
②應(yīng)用胃蛋白酶蛋白水解作用。加5μl細(xì)胞混懸液于載片上，空氣干燥30min或在80℃烤箱中干燥。胃蛋白酶（2500～3500單位/mg蛋白質(zhì)，Sigma,USA)應(yīng)用0.01mol/L HCl稀釋至50～400μg/ml，10min 37℃；再用0.03% H2O2和PBS漂洗，以4%多聚甲醛固定，0℃，5min；載片脫水，空氣干燥，在80℃加熱變性30min。這個方法較①更好，能移除蛋白質(zhì)、暴露核DNA和有助于探針的穿透，最重要的能較好的保持形態(tài)學(xué)的結(jié)構(gòu)，以利于ISHH的熒光信號的顯示。應(yīng)用①法，細(xì)胞經(jīng)常呈扁盤狀，而且細(xì)胞質(zhì)的自動熒光未完全消失，影響ISHH熒光信號的顯示，但實驗表明，必須嚴(yán)格掌握胃蛋白酶的濃度，過低，由于細(xì)胞質(zhì)的覆蓋，基因拷貝數(shù)會減低，而過高濃度的胃蛋白酶會導(dǎo)致過度消化影響細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。
（3)組織切片處理
①冷凍切片：切片厚5μm，放置有粘附劑的載片上，空氣干燥，固定在4%多聚甲醛-PBS溶液，0℃，15min。固定后以PBS和0.01n HCl漂洗，以胃蛋白酶（20～100μg/ml，用0.01N HCl配制)，37℃，30min，PBS漂洗2×5min，在4%多聚甲醛內(nèi)固定15min（0℃)，PBS洗2×5min，系列等級乙醇脫水，空氣干燥。雜交前，在80℃加熱30min使之變性。
②石蠟切片：切片厚5μm，漂洗在40℃溫水中，撈片于有粘附劑的載片上，空氣干燥，56℃加熱1～16h，二甲苯脫蠟2×3min甲醇沖洗2×5min。應(yīng)用1%H2O2（用甲醇配)溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性。以甲醇沖洗，空氣干燥，以胃蛋白酶（4mg/ml,用0.2n HCl配)37℃ 30min。消化后，載片以PBS沖洗。在雜交前，載片孵育于1%甘氨酸溶液-PBS中15min，以PBS沖洗和系列酒精脫水，空氣干燥。載片在80℃孵育30min使之變性。
2．雜交本實驗的雜交液略區(qū)別于其它實驗，否則染色體1號和18號的DNA探針不僅結(jié)合1號和18號染色體，還會同時結(jié)合染色體9，6，13，21。雜交液配方：
甲酰胺 60%（V/V，2×SSC配，pH5.0)
鯡魚精子DNA 1μg/μl
余與一般雜交液配制相同
對多靶點ISHH，須另加入1mmol/L KCN入雜交液，每張載片加5μl的含特異性DNA探針（2.5ng/μl)的雜交液，以蓋片覆蓋，四周用橡皮泥封固，先在80℃熱板上5～10min使DNA變性，細(xì)胞混懸液制片變性時間只需2.5min，然后在37℃雜交，孵育過夜。
3．雜交后漂洗同本節(jié)�。ǘ�)雜交后漂洗步驟。
4．顯示步驟根據(jù)標(biāo)記物的種類（同位素、熒光素、生物素或地高辛)分別進(jìn)行顯示（與第二十章 中敘述相同)。
5．結(jié)果在光鏡下可見染色體結(jié)構(gòu)的改變，如在膀胱腫瘤細(xì)胞，其DNA含量經(jīng)FCM顯示高于正常組織1倍，在雙靶ISHH顯示載片上，可見腫瘤細(xì)胞間期核內(nèi)，1號染色體為3倍體，而18號染色體為2倍體。在腫瘤細(xì)胞內(nèi)應(yīng)用雙重靶點或多重靶點ISHH技術(shù)可見細(xì)胞間期核內(nèi)多個染色體的眾多畸變相。
ISHH技術(shù)作為一項快速與敏感的偵檢細(xì)胞間期細(xì)胞核內(nèi)染色體畸變的新技術(shù)，可結(jié)合病理材料的常規(guī)組織切片、免疫組化染色和FCM等對病檢材料做出早期的、準(zhǔn)確的診斷，并對腫瘤的預(yù)后與進(jìn)展等有所了解。本技術(shù)成功的關(guān)鍵在于具有特異性的DNA探針和ISHH的偵檢程序，比如染色體的拷貝數(shù)與腫瘤細(xì)胞前處理的方法有關(guān)，如移除蛋白質(zhì)不徹底，就會使偵檢到的染色體拷貝數(shù)減少。又如在切片上進(jìn)行細(xì)胞間期染色體的ISHH時，常見到一些細(xì)胞核碎片呈不同形狀的斑點狀（在涂片上不會出現(xiàn)此種圖像)。對ISHH所獲得資料的分析，須經(jīng)過反復(fù)的實踐，比如模糊的或分裂的斑點可以是非整倍體（aneuoploidy)的假陽性反應(yīng)，產(chǎn)生于細(xì)胞周期的G2期。
（一)基本原理
利用性染色體X或Y的特異性DNA探針的ISHH技術(shù)進(jìn)行胎兒生前（Prenatal)性別的診斷，樣品取自于羊水、絨毛或胎兒的血液。近年，科技工作者又成功地進(jìn)行了胚前（pre-embry－o)或植入前（preimplantation)的ISHH診斷。所謂胚前診斷是在受精卵植入子宮內(nèi)膜前的4～6細(xì)胞期，以顯微操縱器（micromanipulator)或微型吸管穿破透明帶，將分裂球或其中的部分細(xì)胞吸出放入培養(yǎng)液內(nèi)，應(yīng)用ISHH技術(shù)進(jìn)行性染色體的分析，如有染色體畸形，可及早移除，避免以后進(jìn)行人工流產(chǎn)術(shù)。本技術(shù)可還用于鑒別精子是帶X或Y染色體。如果1個婦女遺傳性基因是與X染色體相聯(lián)系的，那么可給予人工授精只帶X染色體的精子以避免其子代有遺傳疾病的危險。當(dāng)然帶X染色體的精子的分離技術(shù)還有待于研究和建立。目前這還是一種實驗性設(shè)想。羊水可在16～20周妊娠期吸取。在18～19周時，20ml的羊水內(nèi)大約含100萬個細(xì)胞，含大約7μgDNA。絨毛膜的絨毛可在3～6月取，每次可獲5～50mg的組織。應(yīng)注意在應(yīng)用前清除母體細(xì)胞。胎血0.2～0.7ml可在17～40周采取，在15～21周，胎血中含2×109白細(xì)胞/L和類似數(shù)量的有核紅細(xì)胞（Miller et al, 1985)。在32～34周，有核紅細(xì)胞的比例數(shù)降至0～50/每100個白細(xì)胞。這種以性染色體為探針的ISHH技術(shù)，可應(yīng)用于分裂中期的染色體鋪片上，也可以應(yīng)用于間期細(xì)胞核制片。性染色體ISHH技術(shù)在下列場合特別有用，如（1)當(dāng)無足夠的分裂細(xì)胞供可靠的細(xì)胞遺傳學(xué)分析時；（2)當(dāng)胎兒面臨性染色體連鎖遺傳性疾病的危險而需做迅速的性別確定時；（3)協(xié)助鑒別45，X/46，XY鑲嵌和其它異常染色體的鑲嵌類型；（4)當(dāng)一雌性具有一Y染色體的雜交時，應(yīng)檢查其父母的血樣品，因為在正常情況下有部分的雄性具有2個Y染色體。這里只敘述了性染色體在ISHH技術(shù)的應(yīng)用，如用同樣技術(shù)標(biāo)記其它染色體也可能對其它遺傳性疾病進(jìn)行診斷，如Julien等（1986)曾應(yīng)用染色體21號DNA探針于間期細(xì)胞核，出現(xiàn)3倍體，為常見遺傳性疾病Down氏綜合征的診斷特征（發(fā)病率為1/700出生者)，同樣，在Edward氏綜合癥（遺傳性疾病出現(xiàn)率1/3000出生者)顯示18號染色體為3倍體。West實驗室進(jìn)行了大量的性染色體的ISHH實驗，并比較了各種標(biāo)記物的優(yōu)缺點，他經(jīng)反復(fù)實驗后承認(rèn)非放射性同位素標(biāo)記物如生物素、地高辛具有許多優(yōu)點，但在性染色體的ISHH顯示，他認(rèn)為至少在他的實驗室同位素3H的標(biāo)記優(yōu)于其它的標(biāo)記物。
（二)基本操作方法
1．Y染色體3H標(biāo)記DNA探針原位雜交技術(shù)
（1)探針標(biāo)記，以3H標(biāo)記Y染色體DNA探針（詳見第19章 )。
（2)原位雜交
①RNA酶的前處理：取1ml RNA酶保存液（10mg/ml)于250ml 2×SSC內(nèi)，預(yù)熱于37℃水浴中。選具有適量的細(xì)胞分布的載片孵育于稀釋的RNA酶溶液中，37℃，1h。系列等級乙醇脫水，70%，90%，100%乙醇各2min，空氣干燥。
②相當(dāng)250ml的預(yù)雜交液（含70%甲酰胺，0.6×SSC配)，70℃水浴。置載片于此預(yù)雜交液內(nèi)2min以使靶DNA變性，如（1)經(jīng)系列等級乙醇脫水，空氣干燥。
③DNA探針準(zhǔn)備與變性
雜交液：10×SSC20%
tRNA 10%
甲酰胺 50%
硫酸葡聚糖 20%
DNA探針-3H 20%
均勻混合，70℃水浴5min使探針變性，然后迅速置冰上冷卻。
10×SSC：1.2mmol/L NaCl
0.15mmol/L醋酸鈉
0．2mol/L NaPO4
tRNA(SigmaR1759)4mg/ml(用TE緩沖液配)，-4℃保存。
TE緩沖液：10mmol/L Tris,1mmol/L EDTA,Ph7.5。
每張載片加20μl含探針的雜交液，覆以蓋玻片，四周用橡皮泥封固，于37℃孵育過夜。可測定3H的放射比性，以了解每張載片的探針含量。
④雜交后漂洗，次日移除蓋玻片，用緩沖液39℃漂洗
50%甲酰胺1×SSC 4×5min
1×SSC 39℃ 4×5min
⑤系列等級乙醇脫水，70%，90%，100%各2min，空氣干燥。
（3)放射自顯影（詳見二十章 第一節(jié) )：浸入核乳膠，暗盒于冷室或4℃冰箱儲存，顯影，定影，復(fù)染，封固和觀察。應(yīng)用3H標(biāo)記pHY2.1DNA探針，其曝光時間大約為6～7日。
2．雜交前精子的處理
（1)取1ml用緩沖液清洗過的精子，加1ml 6mmol/L EDIT(60μl 0.2mol/L EDTA加1940μl的BWW培養(yǎng)基)。留置于室溫5～10min，離心（1000rpm(175×g)5min。
（2)棄上清液，沉淀的精子內(nèi)加1ml 2mmol/L DTT(dithiothretiol, DTT,二硫蘇糖醇)，配法：154μl的DTT加1846μl(4g/ml)BWW培養(yǎng)基（Gibbers et al, 1971)，置室溫45min,再離心1000rpm 5min。
（3)棄上清液，用BWW培養(yǎng)基再稀釋、離心。
（4)加新鮮配制固定劑（甲醇：醋本以=3：1)，反復(fù)混勻或置于漩渦式的混勻器上混勻，室溫30～60min，離心。
（5)加數(shù)滴新鮮固定劑于離心管中，如上再混勻。迅速從混勻液中取2～3滴精液滴于載玻片上，空氣干燥，以相差顯微鏡檢查確有精子存在，保存在清潔的干盒中備用。
（6)在ISHH以前，取出載片，加數(shù)滴0.05% SDS(20μl 0.05% SDS/每2ml BWW培養(yǎng)基)，靜置5min，傾去SDS（十二烷基磺酸鈉，配制法見附錄2)，以2×SSC漂洗，系列等級乙醇脫水，70%，90%，100%各2min，空氣干燥。
（7)雜交步驟同上，雜交后以0.5%伊紅黃（Eosin yellow)復(fù)染，自來水沖洗，空氣干燥，DPX封固。
本節(jié) 簡要介紹了ISHH技術(shù)在染色體鋪片應(yīng)用的三個方面，并摘要介紹了它們的應(yīng)用及操作方法。由于這一技術(shù)在國際上也處于剛起步階段，其發(fā)展主要在近10年，國內(nèi)尚未開展，因此，此一技術(shù)的應(yīng)用還有待于不斷的摸索與完善。必須說明的是ISHH在染色體制片的應(yīng)用也需設(shè)置對照實驗組（詳見第二十章 第一節(jié))。
