一、抗血清的鑒定
動物血采集后,立即分離出血清,此抗血清在保存或應(yīng)用前,必須作效價(jià)和特異性鑒定。
(一)雙向免疫擴(kuò)散法鑒定抗體的特異性zxtf.net.cn/kuaiji/
按雙向免疫擴(kuò)散技術(shù)打兩排孔,上排放抗原粗提物(如抗原來自動物血清則放相應(yīng)的混合血清)和純化抗原,下排加抗血清,進(jìn)行雙擴(kuò)散18~24h后,仔細(xì)觀察上下兩排孔之間出現(xiàn)的沉淀線。若與粗抗原及純抗原之間皆出現(xiàn)一條沉淀線,且兩者互相融合,則證明該動物已產(chǎn)生單價(jià)特異性抗體;不出現(xiàn)沉淀線,表明示免疫成功。若與純化抗原出現(xiàn)一條,而與粗抗原出現(xiàn)多條線,且其中一條沉淀線與純抗原沉淀線相連接,也是成功的免疫,待取血后將雜抗體吸收去除,可以成為單價(jià)特異性抗體。
(二)雙向免疫擴(kuò)散法則定抗血清效價(jià)
測定抗血清效價(jià)有兩種稀釋方法:一是稀釋抗血清,如1/2、1/4、1/8、1/16對倍稀釋,分別與一個(gè)濃度的純抗原反應(yīng);另一是稀釋抗原,即把抗原作對倍稀釋或按濃度(如mg/ml)進(jìn)行稀釋,分別與不同濃度的抗血清進(jìn)行雙擴(kuò)散試驗(yàn)(稱為棋盤滴定),見表10-1。
表10-1抗血清效價(jià)測定
抗原 | 抗血清 | |||||||
不稀釋 | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 | 1/32 | 1/64 | 1/128 | |
不稀釋 | +++ | +++ | +++ | ++ | ++ | + | - | - |
1/2 | +++ | +++ | +++ | ++ | ++ | + | - | - |
1/4 | +++ | +++ | +++ | ++ | ++ | + | - | - |
1/8 | +++ | ++ | ++ | ++ | + | + | - | - |
1/16 | ++ | ++ | ++ | + | + | + | - | - |
1/32 | + | + | + | + | - | - | - | - |
1/64 | + | + | + | + | - | - | - | - |
表中+~+++代表出現(xiàn)沉淀線的濃度,如1:8抗體出現(xiàn)中等濃度沉淀線,與1:16、1:32則出現(xiàn)較弱的沉淀線。按表1zxtf.net.cn/job/0-1的互為比例稀釋后確定抗血清的效價(jià)為1:32,最佳抗原濃度為1:16。效價(jià)在1:8以上即可采用于一般試驗(yàn)。
(三)其他鑒定方法
有時(shí),因抗原特殊,沉淀線不易出現(xiàn),特別是制備的抗血清將用于某種試驗(yàn)時(shí),則考慮用其它方法(如血凝試驗(yàn)、抑制試驗(yàn)、中和試驗(yàn)、放射免疫技術(shù)等)測定其效價(jià)。
二、抗血清的保存
抗血清保存有三種方法。第一種是4℃保存,將抗血清清除菌后,液體狀態(tài)保存于普通冰箱,可以存放3個(gè)月到半年,效價(jià)高時(shí),一年之內(nèi)不會影響使用。保存時(shí)要加入0.1%~0.2%NaN3以防腐。如若加入半量的甘油則保存期可延長。第二種方法是低溫保存,放在-20~-40,一般保存5年效價(jià)不會有明顯下降,但應(yīng)防止反復(fù)凍融,反復(fù)凍融幾次則效價(jià)明顯降低。因此低溫保存應(yīng)用小包裝,以備取出后在短期內(nèi)用完。第三種方法是冰凍干燥,最后制品內(nèi)水分不應(yīng)高于0.2%,封裝后可以長期保存,一般在冰箱中5~10年內(nèi)效價(jià)不會明顯降低。