免疫學(xué)和免疫學(xué)檢驗:第五節(jié)　免疫復(fù)合物的檢測

免疫復(fù)合物在體內(nèi)存在有兩種方式，一是存在于血液中的循環(huán)免疫復(fù)合物（CIC)，一是組織中固定的免疫復(fù)合物。免疫復(fù)合物的檢測技術(shù)可分為抗原特異性方法和非抗原特異性方法。在大多數(shù)情況下，免疫復(fù)合物中的抗原性質(zhì)不太清楚或非常復(fù)雜，所以抗原特異性方法并不常用。

一、循環(huán)免疫復(fù)合物的檢測

根據(jù)免疫復(fù)合物的物理學(xué)、免疫學(xué)和生物學(xué)特性，已經(jīng)設(shè)計出很多檢測CIC的方法（表24-4)，本章只述及常用的代表性方法。

表24-4 循環(huán)免疫復(fù)合物的常用檢測方法

（一)物理測定法

1．聚乙二醇法聚乙二醇（PEG)是乙二醇聚合而成的無電荷形多糖分子，分子量變化范圍較大，常用的分子量是6000。用3％～4％濃度的PEG可以選擇性地將大分子免疫復(fù)合物沉淀下來，其作用機制尚不甚清楚。將PEG溶液與待檢血清混合，置4℃冰箱過夜后離心，將沉淀物用PEG溶液充分洗滌，重新溶解于0.01mol/L的NaOH中，在波長280nm下測量溶液的吸光度；也可利用散射比濁法直接測定PEG沉淀的免疫復(fù)合物；以不同濃度的熱聚合IgG作為參考標準來計算CIC的含量。

聚乙二醇法簡單易行，可在臨床工作中推廣。但此法易受多種大分子蛋白和溫度的干擾，特異性稍差。PEG法還特別適用于沉淀獲得CIC，再進行解離分析其中的抗原與抗體。

2．冷球蛋白測定在某些病理情況下，血清中的免疫復(fù)合物具有可逆性冷沉淀的特性，于4℃冰箱中放置1～3天可自發(fā)地沉淀下來（參見第二十六章)；此種情況多見于冷球蛋白血癥，所涉及的抗原包括自身的IgG、IgM、核苷酸、腫瘤相關(guān)抗原、腎小管上皮、甲狀腺球蛋白、紅細胞基質(zhì)等，還有外源性抗原如乙肝病毒、EB病毒、巨細胞病毒、牛白蛋白和馬蛋白等。

（二)補體相關(guān)測定法

IgG和IgM類抗體與抗原結(jié)合后，重鏈CH2區(qū)的補體結(jié)合點暴露，可以固定C1q并激活補體的系列反應(yīng)，這是利用補體有關(guān)技術(shù)檢測免疫復(fù)合物的基礎(chǔ)。

1．C1q結(jié)合試驗將待檢血清先行加熱56℃30min，以滅活其中的補體和破壞已與CIC結(jié)合的C1q，空出補體結(jié)合點。CIC與C1q的結(jié)合可用多種方法進行檢測，常用的有以下3種。

（1)液相法：先將同位素標記的C1q與滅活過的血清標本混合作用，再加入0.5％（終濃度)的PEG將結(jié)合了C1q的CIC沉淀下來，通過檢測沉淀物中的放射活性來計算CIC的含量。

（2)固相法：先將C1q吸附于固相載體表面，加入待檢血清使CIC與C1q結(jié)合，再加入同位標記的或酶標記的抗人IgG或SPA，最后檢測其放射活性或酶活性。

（3)C1q偏離試驗：先將同位素標記的C1q與滅活的血清標本混合，再加抗體致敏的綿羊紅細胞，溫育后離心，檢測紅細胞上的放射活性。紅細胞的放射活性與免疫復(fù)合物的量呈負相關(guān)。

2．補體試驗本法的原理類似補體結(jié)合試驗。將一定量的補體（多為混合豚鼠血清)與滅活的待檢血清混合溫育，反應(yīng)后加入致敏綿羊紅細胞。如出現(xiàn)溶血表示血清中沒有CIC存在；不溶血說明標本中有CIC存在。將血清標本做不同稀釋，并與已知的熱聚合IgG作對照，可以計算出CIC的含量。本方法的靈敏度較高，且易于在一般實驗室開展，不足之處是特異性較差。

3．膠固素結(jié)合試驗?zāi)z固素（conglutinin)是牛血清中的一種正常蛋白，能與C3d特異性結(jié)合；體內(nèi)與補體結(jié)合的CIC都帶有C3d，因此膠固素可與CIC結(jié)合。用一定量的膠固素包被塑料管，往管中加入稀釋的血清標本，溫育后再加入同位素標記或酶標記的抗人IgG抗體，最后檢測各管的放射活性或酶活性，計算CIC的含量。

膠固素性質(zhì)穩(wěn)定、容易保存、來源方便、價格便宜，檢測方法也不復(fù)雜，便于推廣。本法的不足是只能檢出已結(jié)合補體的CIC，但不論何種激活途徑都一樣檢出，并可用作CIC分離。

（三)抗球蛋白測定法

類風(fēng)濕因子（RF)為抗IgG的自身抗體，與變性IgG、熱聚合IgG和IC都有較強的親和力。單克隆RF（mRF)可從待發(fā)性冷球蛋白血癥的血清中提取，多克隆RF（pRF)可從類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的血清中提取。用mRF比pRF的敏感性更高一些。

1．mRF固相抑制試驗將mRF吸附于固相載體上，隨后加入血清標本，再加入同位素標記的可溶性熱聚合IgG。如果標本中含有IC，固相mRF已與IC結(jié)合，熱聚合IgG與mRF的結(jié)合使被抑制，所以固相中的放射活性與CIC的含量呈負相關(guān)。

也可用同位素標記的mRF先與血清標本反應(yīng)，再加入熱聚合IgG附著的瓊脂糖zxtf.net.cn珠，溫育并離心洗滌后測量沉淀物的放射強度，測定值與CIC的含量呈負相關(guān)。此法的敏感性比前法更高一些。

2．pRF膠乳凝集抑制試驗將pRF與血清標本混合，再加入IgG致敏的膠乳懸液。如果標本中有CIC存在，則pRF先與之結(jié)合，凝集反應(yīng)呈陰性。

3．抗抗體法抗抗體可存在于極個別的健康人血清中，是一種抗IgGF(ab＇)₂的IgM類抗體，能與已結(jié)合抗原的IgG反應(yīng)，但不與游離的IgG或熱聚合IgG反應(yīng)，因而特異性較高。先將抗抗體與待檢血清混合，再加入IgG致敏的人O型Rh⁺紅細胞；如標本中有CIC存在，抗抗體被中和，致敏紅細胞不出現(xiàn)凝集。

以上各種抗球蛋白試驗以mRF法敏感性最高，但是mRF較難尋找。這類方法易受內(nèi)源性RF的干擾，最好先行檢查并除去標本中的內(nèi)源性RF后再行試驗。若遇標本中有聚合Ig，RF法也易出現(xiàn)假陰性；改用抗抗體法可避免這種現(xiàn)象，但是抗抗體的來源困難。

（四)細胞技術(shù)測定

有些細胞表面具有Fc受體和（或)補體受體，可與免疫復(fù)合物相應(yīng)成分特異性結(jié)合，因而可用來對免疫復(fù)合物進行檢測。

1．Raji細胞試驗Raji細胞是從Burkin淋巴瘤患者分離的一種B細胞株，表面有大量C1q、C3b和C3d受體，但無表面免疫球蛋白；因此Raji細胞能與帶有補體的免疫復(fù)合物結(jié)合。先在塑料管中加處一定量的Raji，再加入待檢血清，充分作用后離心洗滌；最后加入熒光素標記的抗人IgG，洗滌后細胞表面顯現(xiàn)熒光為試驗陽性；但熒光法只能做定性檢測�；蚣尤胪�位素標記的抗人IgG，離心洗滌后檢測沉淀細胞的放射活性；以熱聚合IgG作參考標準，可繪制出CIC含量與放射活性的標準曲線，從而求得待測標本中CIC的含量。

Raji細胞法敏感性高、特異性強、方法簡單、不受DNA與內(nèi)毒素的影響；但Raji細胞表面還有Fc受體，因此被檢血清中的游離IgG通過Fc段與Raji細胞結(jié)合，造成假陽性。在待檢標本中有抗淋巴細胞抗體時也可導(dǎo)致假陽性。再則，維持Raji細胞的培養(yǎng)較困難，培養(yǎng)條件的變化可改變Raji細胞表面受體的數(shù)目及親和性，影響檢測敏感性。

2．人紅細胞法人紅細胞表面具有C3b受體，可與帶有補體成分的CIC相結(jié)合。將待檢血清與4％的人O型紅細胞懸液等量混合，37℃溫育后離心洗滌；加入同位素標記的抗人IgG抗體，再溫育洗滌后測定紅細胞的放射活性；以熱聚合IgG作參考標準計算出標本中CIC含量。但該法只能檢測已結(jié)合補體的CIC。

其他細胞法如血小板凝集試驗、玫瑰花環(huán)形zxtf.net.cn/wsj/成抑制試驗、ADCC抑制試驗、巨噬細胞吞噬抑制試驗和中性粒細胞游走抑制試驗等，也都可用來檢測CIC，方法的敏感性也都很高，但這些方法的影響因素多，可重復(fù)性差，所以實際中工作并不多用。

（五)免疫復(fù)合物的成分檢測

免疫復(fù)合物中抗原和抗體的性質(zhì)及各類的檢測對臨床診治疾病及深入研究疾病的免疫病理機制有一定價值。但是由于所涉及的抗原種類很多，例如病原微生物、自身物質(zhì)、各類同種抗原等，檢測方法可分別參見各種抗原的檢測技術(shù)。免疫復(fù)合物中的抗體主要涉及IgG及其亞類、IgM和IgA；方法是將血清中免疫復(fù)合物分離出來，再用雙抗體ELISA夾心法等方法分析抗體的類別。

循環(huán)免疫復(fù)合物的理想檢測方法應(yīng)具備以下特點：①敏感性高，②特異性強，可重復(fù)性好，④操作簡便，⑤適用面廣。目前檢測免疫復(fù)合物的方法雖發(fā)展到幾十種，但還沒有一種方法具備上述所有的特點，綜合相比之下，C1q結(jié)合試驗、膠固素結(jié)合試驗、Raji細胞試驗和RF抑制試驗等方法比較好些。如果方法得當、試劑合格、標本新鮮、操作小心、分析謹慎、CIC測定就會有較大的參考價值。

二、組織固定免疫復(fù)合物的檢測

確定免疫復(fù)合物病的直接證據(jù)不是檢出CIC，而是在病變部位查到固定的IC沉積。在一些自身免疫病和免疫復(fù)合物病，例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、部分腎小球腎炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)性多動脈炎和尋常型天皰瘡等，組織沉積免疫復(fù)合物的檢出對疾病的診斷和發(fā)病機制的研究都比CIC的檢出更有意義。

檢測組織沉淀免疫復(fù)合物常用免疫組織化學(xué)技術(shù)，首先從適當?shù)牟±聿课徊扇〗M織標本做冰凍切片，用熒光標記物的抗人IgG或抗人C3染色，在熒光顯微鏡下見到相應(yīng)部位顯示熒光為陽性反應(yīng)（詳見第十七章)；也可用酶標抗人IgG或抗人C3與標本切片反應(yīng)，再用酶的底物溶液顯色，用普通生物顯微鏡即可觀察到相應(yīng)部位被染色（詳見第十五章)。

三、免疫復(fù)合物檢測的意義及應(yīng)用

判定免疫復(fù)合物為發(fā)病機制的證據(jù)有三：①病變局部有IC沉積；②CIC水平顯著升高；③明確IC中的抗原性質(zhì)。第三條證據(jù)有時很難查到，但至少要具備前兩條，單獨CIC的測定不足為憑。人體在健康狀態(tài)下也存在少量的CIC（大約10～20μg/ml)，其生理與病理的界限不易區(qū)分。另外，CIC檢測的方法太多，其原理各不相同，用一種方法測定為陽性，另一種方法檢測可能為陰性；但與免疫組化法一起檢測，其意義就大得多。

目前已經(jīng)明確系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、部分腎小球腎炎和血管炎等疾病為免疫復(fù)合物病，CIC檢測對這些疾病仍是一種輔助診斷指標，對判斷疾病活動和治療效果也有一定意義。在發(fā)現(xiàn)紫癜、關(guān)節(jié)痛、蛋白尿、血管炎和漿膜炎等情況時，可考慮免疫復(fù)合物病的可能性，進行CIC和組織沉積IC的檢測。另外，患有惡性腫瘤時CIC檢出率也增高，但不出現(xiàn)Ⅲ型變態(tài)反應(yīng)的損傷癥狀，稱之為臨床隱匿的IC病，然而這種狀態(tài)常與腫瘤的病情和預(yù)后相關(guān)。