脫落細(xì)胞檢驗(yàn)醫(yī)生除要熟練掌握細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)外,還必須掌握各項(xiàng)操作和染色技術(shù)及觀察方法,所以脫落細(xì)胞學(xué)檢查技術(shù)是重要的學(xué)習(xí)內(nèi)容之一。它包括標(biāo)本采集、制片、固定和染色、鏡下觀察方法及診斷要領(lǐng)等。
正確地采集標(biāo)本是細(xì)胞學(xué)診斷的基礎(chǔ)和關(guān)鍵之一,故要準(zhǔn)確地選擇部位,盡可能在病變區(qū)直接采集細(xì)胞。采集的標(biāo)本必須保持新鮮,盡快制得,以免細(xì)胞自溶或腐敗。盡可能避免血液、粘液等混入標(biāo)本內(nèi),采集方法應(yīng)簡便,操作輕柔,避免病人痛苦和引起嚴(yán)重并發(fā)癥及促進(jìn)腫瘤擴(kuò)散,下面介紿幾種常用的標(biāo)本采集方法。
(一)直視采集法
外陰、陰道、陰道穹窿、宮頸、口www.med126.com腔、肛管、鼻腔、鼻咽部、眼結(jié)膜及皮膚等部位,可以直接用刮片刮取、吸管吸取、刷洗、食管、胃、直腸、氣管和肺內(nèi)支氣管則使用纖維內(nèi)鏡在病灶處直接刷取細(xì)胞制片。
(二)自然分泌液的采集法
1.痰液涂片檢查:痰興高采烈為支氣管等呼吸的分泌物,對支氣管肺癌和其它呼吸道疾病細(xì)胞學(xué)診斷具有重要價(jià)值。
2.尿液涂片檢查:收集尿液中脫落的泌尿道細(xì)胞成分,作泌尿道腫瘤和某些疾病的細(xì)胞學(xué)診斷。
3.乳頭溢涂片檢查:用于導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤和乳腺癌細(xì)胞學(xué)檢查。
4.前列腺液涂片檢查:采用前列腺按摩法取得分泌物,作前列腺細(xì)胞學(xué)診斷。
(三)灌洗洗
向空腔器官或腹腔、盆腔(剖腹探查時(shí))灌注一定量生理鹽水沖洗,使其細(xì)胞成分脫落于液體中,收集灌洗液離心制片,作細(xì)胞學(xué)檢查。
(四)磨擦法
利用磨擦工具在病變部位磨擦,將擦取物直接涂片。常用磨擦工具有海棉磨擦器、線網(wǎng)套、氣囊等?煞謩e用于鼻咽部、食管和胃部病灶的取材。
(五)針穿抽吸法
當(dāng)有胸腔、腹腔、心包腔及關(guān)節(jié)腔積液時(shí),可用針穿抽吸部分積液作細(xì)胞學(xué)檢查。此外某些深部組織器官,如淋巴結(jié)、甲狀腺、軟組織、肝等亦可作細(xì)針穿刺吸取部分細(xì)胞進(jìn)行涂片診斷。
(一)涂片前準(zhǔn)備工作及涂片方法
1.涂片前準(zhǔn)備工作
(1)保證標(biāo)本新鮮,取材后盡快制片。
(2)涂操作要輕巧,避免擠壓以防止損傷細(xì)胞。涂片要均勻,厚薄要適度,太厚細(xì)胞堆疊,太薄細(xì)胞過少,均影響診斷。
(3)玻片要清潔無油漬,先用硫酸洗滌液浸泡沖洗,再用75%乙酸浸泡。
(4)含蛋白質(zhì)的標(biāo)本可直接涂片,缺乏蛋白質(zhì)的標(biāo)本,涂片前先在玻片上涂薄層粘附劑,以防止染色時(shí)細(xì)胞脫落,常用粘附劑為蛋白甘油,由等量生雞蛋白和甘油混合而成。
(5)每位患者的標(biāo)本至少涂兩張玻片,以避免漏診。涂片后立即在玻片一端標(biāo)上編號。
2.涂片制備方法
(1)推片法:用于稀薄的標(biāo)本,如血液,胸、腹水等。取離心后標(biāo)本一小滴滴在玻片偏右側(cè)端,用推片用30度夾角將玻片上檢液輕輕向左推。
(2)涂抹法:適用于稍稠的檢液,如鼻咽部標(biāo)本。用竹棉簽在玻片上涂布,由玻片中心經(jīng)順時(shí)針方向外轉(zhuǎn)圈yin抹;或從玻片一端開始平行涂抹,涂抹要均勻,不宜重復(fù)。
(3)壓拉涂片法:將標(biāo)本夾于橫豎交叉的兩張玻片之間,然后移動兩張玻片,使之重疊,再邊壓邊拉,獲得兩張涂片。該法適用于較粘稠標(biāo)本,如痰液。
(4)吸管推片法:用吸和將標(biāo)本滴在玻片一端,然后將滴管前端平行置于標(biāo)本滴上,平行向另一端均速移動滴管即可推出均勻薄膜。此法亦適用于胸、腹水標(biāo)本。
(5)噴射法:用配細(xì)針頭的注射器將標(biāo)本從左至右反復(fù)均勻地噴射在玻片上,此法適用于各種吸取的液體標(biāo)本。
(6)印片法:將切取的病變組織用手術(shù)切開,立即將切面平放在玻片上,輕輕按印。此方法為活體組織檢查的輔助方法。
(二)涂片的固定
固定(fication)的目的是保持細(xì)胞自然形態(tài),防止細(xì)胞自溶和細(xì)菌所致的腐。还潭ㄒ耗艹恋砗湍碳(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和破下細(xì)胞內(nèi)溶酶體酶,使細(xì)胞不但保持自然形態(tài),而且結(jié)構(gòu)清晰,易于著色。因此標(biāo)本愈新鮮,固定愈及時(shí),細(xì)胞結(jié)構(gòu)愈清晰,染色效果愈好。
1.固定液:細(xì)胞學(xué)檢查常用的固定液有下列三種:第一種乙醚酒清固定液:該固定液滲透明性較強(qiáng),固定效果好適用于于一般細(xì)胞學(xué)常規(guī)染色;二種是氯仿酒精固定液:又稱卡諾氏固定液。其優(yōu)點(diǎn)同上;第三種95%酒精固定液:適用于大規(guī)模防癌普查。制備簡單。但滲透作用稍差。
2.固定方法
(1)帶濕固定:涂片后未待標(biāo)本干燥即行固定的方法稱帶濕因定。此法因定細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚,染色新鮮。適用于巴氏或HE染色。痰液、陰道分泌物及食管拉網(wǎng)涂片等常任常用此方法。
(2)干燥因定:涂片后未待其自然干燥,再行固定。適用于稀薄標(biāo)本如尿液、胃沖洗液等,也適用于于瑞特染色和姬姆薩染色。
3.固定時(shí)間:一般為15-30min。含粘液較多標(biāo)本,如痰液、陰道分泌物、食管拉網(wǎng)等因定時(shí)間在適當(dāng)延長;尿液、胸、腹水等涂片不含粘液,固定時(shí)間可酌情縮短。
(三)涂片的染色
1.染色的目的和原理:染色的日的是借助于一種或多種染料,使組織和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)分別著不同的染色,這樣在顯微鏡下能清楚地觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu),作出正確判斷。
組織細(xì)胞染色原理至今尚無滿意的解釋,可能是物理作用,也可能是化學(xué)作用,或者是兩者綜合作用的結(jié) 果。
染色的物理作用是利用毛細(xì)管現(xiàn)象,滲透、吸收和吸附作用,使染料的色素顆粒牢固地進(jìn)入組織細(xì)胞,并使其顯色。
染色的化學(xué)作用是滲入組織細(xì)胞的染料與其相應(yīng)的物質(zhì)起化學(xué)反應(yīng),產(chǎn)生有色的化合物。
各染料都具有兩種性質(zhì),即產(chǎn)生顏色;征收被組織形成親和力。這兩種性質(zhì)主要由發(fā)色基因和助色基因所產(chǎn)生的。
發(fā)色基團(tuán):苯的衍生物具有可見光區(qū)吸收帶。這些衍生物顯不的吸收帶與其價(jià)鍵的不穩(wěn)定性有關(guān),如對苯二酚為無色,當(dāng)其氧化后失去兩個(gè)氫原子,它的分子或則變?yōu)橛悬S色的對醌,這種產(chǎn)生顏色的醌式環(huán)稱為發(fā)色基團(tuán)。若一種化合物含有幾個(gè)環(huán),只要其中有一個(gè)醌式環(huán)就會發(fā)出顏色,稱此發(fā)色基團(tuán)為色原(chromogen).
助色基團(tuán):是一種能使化合物以生電離作用的輔助原子團(tuán)(酸堿性基團(tuán))。它能使染色的色澤進(jìn)一步加深,并使其與被染色組織具有親和力。
助色基團(tuán)的性質(zhì)決定染料是酸性堿性。堿性染料具有堿性助色基團(tuán),在溶媒中產(chǎn)生的帶色部分為帶正電荷的陽離子,吻與組織細(xì)胞內(nèi)帶負(fù)電荷的物質(zhì)結(jié)合而顯色。如細(xì)胞核內(nèi)的主要化學(xué)成分脫氧化核糖核酸易被蘇木素染成紫藍(lán)色,稱嗜堿性。酸性染料具有酸性用力色基團(tuán),在溶酶中產(chǎn)生帶色部分為陰離子,易與組織細(xì)胞內(nèi)帶正電荷部分結(jié)合而顯色,此性質(zhì)被稱為嗜酸性,如細(xì)胞漿內(nèi)訂成分為蛋白質(zhì),易與伊紅或橘黃結(jié)合呈紅色或橘黃色。
2.常用染色方法:臨床日常工作中較為常用的染色方法有下列3種:
(1)巴氏染色法:本法染色特點(diǎn)是細(xì)胞具有多色性顏色,色彩鮮艷多彩。涂片染色的透明性好,胞質(zhì)顆粒分明,胞核結(jié)構(gòu)清晰,如鱗狀上皮過度角化細(xì)胞胞質(zhì)呈橘黃色;角化細(xì)胞顯粉紅色;而角化前細(xì)胞顯淺綠色或淺藍(lán)色,適用于上皮細(xì)胞染色或觀察陰道涂片中激素水平對上皮細(xì)胞的影響。此方法的缺點(diǎn)是染色程序比較復(fù)雜。
(2)蘇木精—伊紅(hemotoxylin eosin,HE)染色法:該方法染色透明度好,核與胞質(zhì)對比鮮明。染色步驟簡便,效果穩(wěn)定。適用于痰液涂片,觖質(zhì)核呈紫藍(lán)色,胞質(zhì)淡玫瑰紅色,紅細(xì)胞呈淡朱紅色。
(3)瑞特—吉姆薩染色法(wrightgiemsa atain);本方法多用于血液,骨髓細(xì)胞學(xué)檢查。胞質(zhì)內(nèi)顆粒與核安危質(zhì)結(jié)構(gòu)顯示較清晰。操作簡便。
為提高診斷率和防止造成差錯,檢查涂片前必須嚴(yán)格核對涂片編號,了解送檢單上填寫的全部資料;閱片要全面、認(rèn)真、細(xì)心觀察。
因涂片中細(xì)胞成分分布極為分散,所以顯微鏡觀察時(shí)必須按順序視全張涂片,用推進(jìn)器從左至右。自上而下移動,仔細(xì)觀察每一個(gè)視野,歸后將蓋片邊緣亦做仔細(xì)檢查,經(jīng)防止漏診(圖20-1)。
圖20-1 觀察切片的移動法
A錯誤的玻片移動法
B正確的玻片移動法
涂片細(xì)胞學(xué)檢查十分重視低倍觀察,先宏觀涂片中各種細(xì)胞成分,發(fā)現(xiàn)異常細(xì)胞時(shí),再轉(zhuǎn)換高倍視野,仔細(xì)觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu),明確性質(zhì),做出正確診斷。
(一)細(xì)胞學(xué)診斷的書寫方式
細(xì)胞學(xué)檢查癌細(xì)胞的診斷方式分為直接法和分級法。
1.直接法:根據(jù)細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果,直接寫出關(guān)于疾病的診斷如痰抹片檢查結(jié)果為“倆支氣管鱗癌”。
2.分級法:將涂片中細(xì)胞學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞變化,用分級方式表示。它的優(yōu)點(diǎn)是能真實(shí)地反映細(xì)胞學(xué)所見。較這客觀。目前有三級、四級、和五級三種分類方法。五級分類法過于繁瑣,實(shí)際應(yīng)用中較難掌握。因此國內(nèi)仍常用三級或四級分類法,該兩種分類法較為簡單明確,易于掌握,能夠更準(zhǔn)確地反映涂片的本質(zhì)。
(1)三級分類法:將細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果分為陰性,可疑和陽性三級。
Ⅰ級:陰性:無核異質(zhì)細(xì)胞,涂片中均為正常細(xì)胞或一般退變細(xì)胞。
Ⅱ級:可疑。涂片中發(fā)現(xiàn)核異質(zhì)細(xì)胞,但不能肯定的是腫瘤細(xì)胞,應(yīng)重復(fù)送檢。
Ⅲ級:陽性。涂片中發(fā)現(xiàn)典型癌細(xì)胞,有時(shí)根據(jù)癌細(xì)胞形態(tài)特征及分布,初步進(jìn)行分類。
(2)四級分類法:將細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果分為陰性、核異質(zhì),可疑和陽性四級。
Ⅰ級:陰性。
Ⅱ級:核異質(zhì)。涂片中發(fā)現(xiàn)少量核異質(zhì)細(xì)胞,由高度炎癥增生所www.med126.com致。
Ⅲ級:可疑。涂片中見重度核異質(zhì)細(xì)胞,其形態(tài)基本符合惡性腫瘤細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn),但數(shù)量過少,還不能完全排除癌前期病變或高度炎癥墳生的可能,建議臨床重復(fù)送檢。
Ⅳ級:陽性。
(3)五級分類法
Ⅰ級:無核異質(zhì)細(xì)胞。
Ⅱ級:少量輕度核異質(zhì)細(xì)胞,但無惡性證據(jù)。
Ⅲ級:有較多重度核異質(zhì)細(xì)胞,但不能肯定為惡性。
Ⅳ級:有大量重度核異質(zhì)細(xì)胞,但仍缺乏典型惡性腫瘤細(xì)胞的證據(jù)。
Ⅴ級:發(fā)現(xiàn)典型惡性腫瘤細(xì)胞,根據(jù)其細(xì)胞形態(tài),作出初步的分類。
(二)提高細(xì)胞學(xué)診斷的要領(lǐng)
1.熟練掌握病理學(xué):脫落細(xì)胞來自組織,所以是病變組織的部分反映,具有踏實(shí)的病理學(xué)基礎(chǔ),才能對千變?nèi)f化的脫落細(xì)胞形態(tài)作出正確的判斷。
2.多思考、多比較:涂片中細(xì)胞成分,背景成分以及細(xì)胞變性程度等每例各不相同,閱片時(shí)要分析思考和比較,最好用涂片中某一背景成他,如淋巴細(xì)胞或紅細(xì)胞作標(biāo)本。
3.密切結(jié)合臨床:多與臨床醫(yī)生聯(lián)系,了解臨床癥狀,化驗(yàn)及影像診斷結(jié)果,避免盲目性。
4。認(rèn)識脫落細(xì)胞學(xué)的局限性:無充分證據(jù),寧可保存守一點(diǎn)。未肯定的報(bào)告對臨床亦有參考價(jià)值。
5.了解各種染色的特性和優(yōu)缺點(diǎn)因不同染色方法,細(xì)胞表現(xiàn)差別很大。
(三)細(xì)胞學(xué)診斷的誤診原因
細(xì)胞學(xué)診斷誤診造成臨床診斷的錯誤,以致影響對患者疾病的診斷治療。誤診形式有假陽性和假陰性兩種。前者是在非腫瘤患者涂片中找到所謂的癌細(xì)胞;后者是在腫瘤患者涂片內(nèi)未找到癌細(xì)胞。
細(xì)胞學(xué)檢查從取材到最后診斷,任何一個(gè)步驟處理不當(dāng),均可產(chǎn)生誤診。引起的誤診原因有以下幾種:
1.標(biāo)本取材不當(dāng):未取到真有癌細(xì)胞部分,如痰液制片時(shí)未仔細(xì)選擇有效病理成分;或患者咳痰方式不對,未采集到支氣管深部分泌物等。
2.標(biāo)本不新鮮:細(xì)胞學(xué)檢查標(biāo)本必須在采集后1-2小時(shí)內(nèi)涂片,立即固定,以防止細(xì)胞自溶。
3.編號錯誤:會發(fā)生誤診嘏造成醫(yī)療事故。故送檢標(biāo)本、申請單、涂片、報(bào)告單編號后應(yīng)仔細(xì)核對,避免出現(xiàn)差錯。
4.細(xì)胞污染:涂片在固定和染色過程中,不斷有細(xì)胞脫落于試劑中,這些細(xì)胞有可能粘附在其它患者涂片上而造成誤診,故要經(jīng)常過濾或現(xiàn)換試劑。
5.觀察不仔細(xì)或方法不正確而發(fā)生的漏誤。
6.腫瘤細(xì)胞分化好,與正常細(xì)胞不易區(qū)別。
7.經(jīng)放療或化療后,正常上皮細(xì)胞受射線作用,有明顯的形態(tài)學(xué)改變,吻誤診為癌細(xì)胞。