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1.2.4 MSC生長(zhǎng)曲線測(cè)定：取P3代細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至4×107/L，接種于24孔培養(yǎng)板(每孔200μL，37℃,體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的飽和濕度環(huán)境)培養(yǎng)，每3 d換液1次。從第2天起每隔24 h計(jì)數(shù)3孔細(xì)胞數(shù)，取其平均值作為當(dāng)天細(xì)胞數(shù)，以細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，天數(shù)(8d)為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
1.2.5 MSC增殖能力鑒定：分離5×106個(gè)骨髓單個(gè)核細(xì)胞為起始在體外培養(yǎng)擴(kuò)增MSCs，至P3、P4、P5代分別計(jì)數(shù)獲得的MSCs數(shù)，將CMS組與對(duì)照組進(jìn)行比較。
1.2.6 MSC傳代能力比較：分離5×106個(gè)骨髓單個(gè)核細(xì)胞為起始在體外培養(yǎng)擴(kuò)增MSCs，進(jìn)行傳代，記傳代次數(shù)，將CMS組與對(duì)照組進(jìn)行比較。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法
采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析計(jì)算。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用成組t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率表示，兩組比較采用Fisher確切概率法檢驗(yàn);生長(zhǎng)曲線結(jié)果采用重復(fù)測(cè)量方差分析。顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。
2 結(jié)果
2.1 骨髓MSC的生長(zhǎng)形態(tài)觀察
倒置顯微鏡下觀察，可見(jiàn)接種后24～48 h少部分單個(gè)核細(xì)胞貼壁，貼壁細(xì)胞呈圓形，有小的胞質(zhì)突起。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，貼壁細(xì)胞開(kāi)始分裂增殖，細(xì)胞呈現(xiàn)出成纖維細(xì)胞樣梭形外觀，胞質(zhì)豐富，核大居中，核仁明顯，1周后，細(xì)胞融合成單層，形態(tài)均一，梭形突起變長(zhǎng)，呈長(zhǎng)梭形。貼壁的MSC增殖迅速，培養(yǎng)到10～14 d時(shí)，呈現(xiàn)90%以上的細(xì)胞融合，排列有明顯方向性，細(xì)胞呈平行狀、旋渦狀、網(wǎng)狀或輻射狀生長(zhǎng)。胰酶消化傳代及凍存復(fù)蘇后的細(xì)胞于24 h后完全貼壁，形態(tài)與原代相似。瑞士姬姆薩染色后，于光鏡下可見(jiàn)成纖維樣細(xì)胞形態(tài)，胞漿呈淡藍(lán)色，可含空泡，可見(jiàn)數(shù)個(gè)深藍(lán)色的核仁，染色質(zhì)疏松，細(xì)胞呈平行排列生長(zhǎng)或漩渦狀生長(zhǎng)(見(jiàn)圖1)。CMS患者與對(duì)照組骨髓來(lái)源的MSC形態(tài)上差別不明顯，兩組MSC貼壁時(shí)間、集落大小無(wú)明顯差異，均在36～48 h時(shí)間內(nèi)貼壁。
圖1 慢性高原病骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)(40×)
2.2 骨髓MSC表面標(biāo)志分析醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站zxtf.net.cn
流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，CMS組與對(duì)照組骨髓MSC均不表達(dá)典型的造血細(xì)胞抗原分子，如CD34、CD45、HLADR、CD4、CD8、CD80等，而CD29、CD105、CD13表達(dá)為陽(yáng)性，其表達(dá)量在兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
2.3 CMS和對(duì)照組MSCs第三代(P3)生長(zhǎng)曲線分析
CMS組骨髓MSCs在第4～5 d生長(zhǎng)活躍，7 d后生長(zhǎng)達(dá)平臺(tái)期，對(duì)照組培養(yǎng)6 d后生長(zhǎng)達(dá)平臺(tái)期，結(jié)果見(jiàn)表1，圖2。
2.4 CMS和對(duì)照組MSCs體外擴(kuò)增數(shù)量比較
