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慢性高原病(chronic mountain sickness，CMS)是高原低壓缺氧環(huán)境引起的一類高原特發(fā)性疾病，隨海拔增高其發(fā)病率呈增高趨勢。經(jīng)多年研究，對紅細(xì)胞增殖相關(guān)機(jī)制有了比較清楚的認(rèn)識，但對CMS尚存很多問題有待進(jìn)一步闡明。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一群主要存在于骨髓中的非造血細(xì)胞，在體外不同的誘導(dǎo)條件下可分化為多種細(xì)胞。除具有多向分化潛能外，MSCs還表達(dá)多種造血細(xì)胞因子，又能分化為支持造血的骨髓基質(zhì)細(xì)胞，且與造血干細(xì)胞的歸巢密切相關(guān)，具有強(qiáng)大的支持造血及免疫調(diào)節(jié)等功能，具有廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值[1]。目前對CMS患者的MSC相關(guān)研究未見報(bào)道，故在此我們探討CMS患者骨髓MSCs的體外培養(yǎng)方法、生物功能及分子生物學(xué)特征。以期進(jìn)一步深化對CMS發(fā)病機(jī)制的研究。
1 資料與方法
1.1 病例資料
選擇15例就診于青海大學(xué)附屬醫(yī)院血液科的CMS患者(CMS組)。患者均為男性，年齡32～45歲，診斷符合第六屆國際高原大會2004年制訂的青海診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。15例對照組骨髓來源于血象和骨髓象正常的外傷性骨折患者的肋骨骨髓，選自青海大學(xué)附屬醫(yī)院骨科患者，本組患者均為男性，年齡24～48歲。兩組間性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站zxtf.net.cn。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 骨髓MSC的分離培養(yǎng)：無菌條件下以CMS患者髂后上嵴為穿刺部位，抽取骨髓液5 mL(以肝素鈉抗凝)，以等體積低糖DMEM稀釋;對照組在無菌條件下將肋骨髓腔以低糖DMEM沖洗后收集骨髓液。稀釋后的骨髓用密度為1.073 g/mL的Percoll分離液(Pharmacia公司)分離單個(gè)核細(xì)胞，DMEM洗滌2次，懸浮于含10%胎牛血清(FBS,Hyclon,美國)的DMEM/F12培養(yǎng)液(Gibco公司)中，采用直接貼壁法，以含10%胎牛血清的DMEM/F12作為培養(yǎng)液，即hMSCs培養(yǎng)液(mesencult medium,stem cell Tech公司)。25 cm2塑料培養(yǎng)瓶(Costar)接種5×106個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，置于37℃、5%CO2的飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。72 h后棄掉未貼壁細(xì)胞，更換培養(yǎng)液，以后每 3～4 d換液1次，待細(xì)胞生長達(dá)90%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶/EDTA(Gibco公司)在37℃下消化貼壁細(xì)胞，收集細(xì)胞并懸浮于hMSCs培養(yǎng)液，按1∶3比例傳代培養(yǎng)，并標(biāo)記為P1;此后可依此傳代培養(yǎng)。傳代過程中每隔3 d全量換培養(yǎng)液，直至貼壁細(xì)胞彼此融合,鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶的底面;再重復(fù)以上的操作，將貼壁細(xì)胞消化分離，并按1∶2的比例進(jìn)行下一代的傳代接種培養(yǎng)，并標(biāo)記為P2。
1.2.2 MSC的形態(tài)學(xué)鑒定：每日在倒置顯微鏡下觀察貼壁細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、密度和生長情況，取1、3、6代MSC，置于有玻片的3.5 cm直徑平皿中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)1周，取出風(fēng)干，用瑞士姬姆薩染色后在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。
1.2.3 MSC表面標(biāo)志的測定：以0.25%胰蛋白酶消化收獲細(xì)胞，用PBS洗滌后計(jì)數(shù)，取2×106個(gè)細(xì)胞分別與 PE或 FITC標(biāo)記的鼠抗人CD29、CD34、CD45、CD13、CD14、CD3、CD4、CD8(BD公司)、CD105(Caltag公司)、HLADR和CD20單克隆抗體室溫避光反應(yīng)30 min，用PBS洗滌2次(1000 r/min,5min/次);加1%多聚甲醛1 mL，搖勻，4℃保存，1周內(nèi)用流式細(xì)胞儀(FACSCaliburBD公司，Cellquest軟件分析)確定所分離培養(yǎng)的MSCs的表型和純度。
