 |
 |
中藥學(xué)論文不同濃度地塞米松對(duì)腭胚突間充質(zhì)細(xì)胞作用規(guī)律
腭裂動(dòng)物模型是研究先天性腭裂發(fā)病機(jī)理的主要手段。通常采用將致畸劑注入正常孕鼠母體內(nèi)誘導(dǎo)胎鼠產(chǎn)生腭裂，建立腭裂動(dòng)物模型。本課題組從上世紀(jì)90 年代即開始通過對(duì)地塞米松誘導(dǎo)的腭裂動(dòng)物模型進(jìn)行發(fā)病機(jī)理的系列研究。以往的研究主要采用孕鼠腹腔注射地塞米松的方式進(jìn)行胎鼠畸形的誘導(dǎo)和組織切片觀察。為了進(jìn)一步闡明地塞米松誘導(dǎo)腭裂畸形的具體生物學(xué)機(jī)制，在細(xì)胞水平上進(jìn)行研究已成為必然。然而，要在細(xì)胞水平研究地塞米松的作用機(jī)理，需要找到一個(gè)適宜的濃度，既能發(fā)揮地塞米松的致畸作用，又不能產(chǎn)生過強(qiáng)的毒性而導(dǎo)致細(xì)胞大量壞死，以保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。本研究旨在觀測(cè)不同濃度地塞米松對(duì)EPM 細(xì)胞生長(zhǎng)的作用規(guī)律，選擇出適宜的地塞米松濃度，為在細(xì)胞水平研究地塞米松的致畸作用機(jī)理奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
1 材料和方法
1.1 材料DMEM/F12（1：1)細(xì)胞培養(yǎng)基（Hyclone，美國(guó))；DispaseII 酶（Sigma，美國(guó))；胰蛋白酶；青霉素；鏈霉素；乙二胺四乙酸（EDTA)（Sigma，美國(guó))；胎牛血清（Fetal bovineserum FBS)（Hyclone，美國(guó))；地塞米松（dexamethasone，Dex)（Solarbio)；3-（4，5- 二甲基噻唑-2 ) -2 ，5- 二苯基四氮唑溴鹽（3－（4 ， 5dimethythiazol-2-yl ) -2 ，5-diphenyterazolium Pomide，MTT)（Sigma，美國(guó))、二甲基亞砜（Dimethylsulphoxide，DMSO)（Sigma，美國(guó))；碘化丙啶（Propidium lodide，PI)（Sigma，美國(guó))。倒置相差顯微鏡（Olympus LX50，日本)；二氧化碳恒溫孵箱（SANYO MCO-17AI，日本)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（Microplate Reader Model 550，Bio-Rad，美國(guó))；體視顯微鏡（OLYMPUS，日本)。
1.2 小鼠腭胚突間充質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)與觀察將 GD12.5 天的C57BL/6J 小鼠斷頸處死，無菌條件下取出胚胎，按照肖[3]的方法獲取腭胚突間充質(zhì)單細(xì)胞懸液。以5×105 個(gè)/瓶接種到75ml 培養(yǎng)瓶中，以及2×104 個(gè)/ml 密度接種于6 孔板中蓋玻片上。將培養(yǎng)瓶移至二氧化碳恒溫孵箱培養(yǎng)。待EPM 細(xì)胞鋪滿蓋玻片的80%左右時(shí)，進(jìn)行HE 染色以及采用SP 法免疫組織化學(xué)染色，運(yùn)用Vimentin， CK 單克隆抗體鑒定EPM 細(xì)胞特異性抗原表達(dá)。脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。
