 |
 |
臨床醫(yī)學(xué)論文凋亡素參與正常細(xì)胞核蛋白表達(dá)差異
1．引言
凋亡素能夠特異引起腫瘤細(xì)胞與轉(zhuǎn)化細(xì)胞的凋亡，這種細(xì)胞凋亡是非P53 依賴的，而不能夠?qū)е抡＜?xì)胞的凋亡，這與凋亡素的核定位有關(guān)。凋亡素是一種在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核之間穿梭的蛋白。無(wú)論是在腫瘤細(xì)胞還是正常細(xì)胞內(nèi)，凋亡素都能夠通過(guò)核定位信號(hào)進(jìn)入細(xì)胞核。然而在腫瘤細(xì)胞中，凋亡素被修飾，導(dǎo)致出核信號(hào)的失活，定位在細(xì)胞核內(nèi)，引起腫瘤細(xì)胞的凋亡；而在正常細(xì)胞中，凋亡素又通過(guò)出核信號(hào)出核，定位在細(xì)胞漿內(nèi)，不引起正常細(xì)胞的凋亡。
綜上所述，腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之間的蛋白表達(dá)一定存在著某種差異，使得凋亡素在腫瘤細(xì)胞中被特異地修飾。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)的方法來(lái)尋找腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞核內(nèi)的蛋白表達(dá)差異，以期望能夠進(jìn)一步探討凋亡素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞特異凋亡的機(jī)制。
2．材料和方法
2.1 實(shí)驗(yàn)材料PureyieldTM Plasmid Midiprep System(Promega)、RPMI1640 細(xì)胞培養(yǎng)基、新生牛血清（GIBCO)、轉(zhuǎn)染試劑LIPOFECTAMINE 2000(Invitrogen)、蛋白酶抑制劑（sigma)、pEGFP-C1、pEGFP-C1-apoptin 由倫敦大學(xué)醫(yī)學(xué)院Tavassoli 博士惠贈(zèng)，JM109 菌株由本室保存，HepG2 細(xì)胞、L02 細(xì)胞由本校遺傳教研室饋贈(zèng)。
2.2 pEGFP-C1-apoptin 載體的提取按照 Promega 公司PureyieldTM Plasmid Midiprep System 提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒的提取。
2.3 細(xì)胞培養(yǎng)用含 RPMI1640、10%新生牛血清的培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2 及飽和濕度的恒溫箱中培養(yǎng)HepG2 細(xì)胞、L02 細(xì)胞，每2d 傳代一次。
2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染進(jìn)行 24 孔板貼壁細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，將pEGFP-C1-apoptin 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染進(jìn)HepG2 和L02兩種細(xì)胞。
2.5 激光共聚焦檢測(cè)apoptin 定位轉(zhuǎn)染后24、 48h 將 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板取出,在各組細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入 Hoechst 33342染液(終濃度為 10μ g/ml), 37℃恒溫避光染色 15min, PBS 洗3 次,去除未結(jié)合的 Hoechst33342, 激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察,拍照。
