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第3次課 授課時間：2006年 月 日
課程名稱 | 年級 | 05級 | 專業(yè)、層次 | 臨床醫(yī)學(xué)等各專業(yè)本科 | ||||
授課教師 | 鄔于川 | 職稱 | 副教授 | 課型（大、小) | 小 | 學(xué)時 | 3 | |
授課題目 | 凝集反應(yīng)、酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA) | |||||||
基本教材及主要參考書 | 醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實驗指導(dǎo) 鄔zxtf.net.cn/wsj/于川主編 瀘州醫(yī)學(xué)院印刷廠2002 P5~8，P34~35 現(xiàn)代免疫學(xué)實驗技術(shù) 沈關(guān)心、周汝麟主編 湖北科學(xué)技術(shù)出版社 1998 | |||||||
目的與要求： 掌握凝集反應(yīng)（玻片法、試管法) 掌握ELISA的原理、方法及結(jié)果分析 | ||||||||
教學(xué)內(nèi)容與時間安排： 觀察上次溶菌酶實驗結(jié)果---10min 自作早早孕檢測（ELISA雙抗夾心法)---30min 自作試管凝集實驗---40min 自作ABO血型鑒定（玻片凝集)---35min 教學(xué)方法：講授、板書、示教 | ||||||||
教學(xué)重點及如何突出重點、難點及如何突破難點： 教學(xué)重點 ABO血型鑒定（玻片法)的原理及結(jié)果分析 ELISA的原理、方法及結(jié)果分析 教學(xué)難點 ELISA的原理、方法及結(jié)果分析 試管凝集試驗的結(jié)果分析 提示：ELISA試驗廣泛應(yīng)用于科研實驗和臨床檢測，故讓學(xué)生熟悉原理及其應(yīng)用較為重要。 | ||||||||
教研室審閱意見： 教研室主任簽名： 年 月 日 | ||||||||
基本內(nèi)容 | 教學(xué)手段 | 課堂設(shè)計和時間安排 |
教學(xué)進程 一 觀察溶菌酶實驗的結(jié)果 1 首先看陰性、陽性對照出現(xiàn)結(jié)果，陰性對照孔周或濾紙片周圍不會出現(xiàn)溶菌環(huán)，而陽性對照孔周或濾紙片周圍出現(xiàn)明顯的溶菌環(huán)， 2 再看待檢標本周圍溶菌環(huán)出現(xiàn)的情況，定量檢測時其直徑與所加標本中溶菌酶的含量成正比。 二 酶聯(lián)免疫吸附實驗 （Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) ELISA是固相吸附技術(shù)和免疫酶標記技術(shù)相結(jié)合的一種方法，它是目前應(yīng)用最廣泛的檢測技術(shù)。它利用了免疫反應(yīng)（即抗原-抗體反應(yīng))的高度特異性和酶促反應(yīng)的高度敏感性（可達ng水平)，進行對抗原或抗體的檢測，是一種定性和定量的綜合性技術(shù)。 抗原或抗體吸附到固相載體表面，仍保持原有免疫活性。而酶標抗體或抗原中，酶活性與免疫活性互不影響，且酶標記物中的酶催化底物顯色，顯色的深淺與相應(yīng)抗原或抗體含量成正比，因此可用酶標儀作定量檢測。 檢測方法有三種： 間接法—常用于抗體檢測；雙抗體夾心法—常用于抗原檢測；競爭抑制法—既可用于抗原檢測，也可用于抗體檢測 下面以早孕孕婦尿HCG檢測為例介紹雙抗體夾心法： 【材料】 ⒈ 包被了抗-HCG的酶標反應(yīng)杯、酶標抗-HCG、洗滌液、底物、顯色液（商品化試劑)。 ⒉ 待檢尿樣。 ⒊ 燒杯、蒸餾水、毛細吸管、吸水紙等。 ⒈ 用毛細吸管向反應(yīng)杯內(nèi)加待檢尿樣1滴，再加酶標抗-HCG1滴，室溫反應(yīng)2min。 ⒉ 杯內(nèi)先加洗滌液1滴，并用蒸餾水加滿反應(yīng)杯后洗滌，倒掉液體并甩干，繼后僅用蒸餾水加滿反應(yīng)杯洗滌5次，用吸水紙拍干杯內(nèi)液體。 ⒊ 加底物1滴。 ⒋ 加顯色劑1滴，室溫反應(yīng)2min。 【結(jié)果】 杯內(nèi)液體無色為陰性、藍色為陽性。可用酶標儀檢測尿中HCG的含量。 【注意事項】 ⒈冰箱中保存的商品化試劑取出恢復(fù)至室溫后再使用。 ⒉洗滌要徹底，防止出現(xiàn)假陽性。 ⒊各試劑的小蓋不要戴錯，否則可造成假陽性。 凝集反應(yīng) 內(nèi)容： 一、直接凝集反應(yīng) （一) 玻片凝集反應(yīng)—細菌的鑒定、ABO血型鑒定 （二) 試管凝集反應(yīng) 二、間接凝集反應(yīng) （一) 正向間接凝集反應(yīng)—間接凝集乳膠試驗、間接血凝試驗 （二) 反向間接凝集反應(yīng)—反向間接血凝試驗、協(xié)同凝集試驗 （三) 間接凝集抑制試驗
三 自作試管凝集實驗 【原理】 本試驗是用已知的顆粒性抗原來檢測未知的抗體及其相對含量，此法屬定量試驗。方法是用生理鹽水將待測血清在試管中進行連續(xù)倍比稀釋，然后于各管中加入等量的已知抗原懸液，經(jīng)過一定時間后，觀察有無凝集并根據(jù)凝集程度判定血清抗體的效價。 【材料】 ⒈傷寒桿菌H菌液。 ⒉傷寒桿菌免疫血清（1∶10稀釋)。 ⒊生理鹽水、小試管、試管架、1ml和5ml刻度吸管等。 【方法】 ⒈ 取潔凈小試管8支列于試管架上，依次編號。 ⒉ 用5ml吸管吸取生理鹽水，每管內(nèi)加入0.5ml。 ⒊ 用1ml吸管吸取待檢血清0.5ml加入第1管，吹吸3次，充分混勻后，吸出0.5ml加入第2管，如上依次稀釋至第7管，自第7管吸出0.5ml棄去。第8管不加血清作為對照管。見圖 4． 用5ml吸管吸取傷寒桿菌菌液，從第8管起向前加，每管加入0.5ml。 5．搖勻后，置室溫或37℃24小時后，觀察結(jié)果。操作程序見表 四 ABO血型鑒定 【材料】 ⑴ 抗A標準血清、抗B標準血清。 ⑵ 載玻片、采血針、碘酒和酒精棉球、牙簽、生理鹽水、毛細吸管等。 【方法】 ⑴ 取潔凈載玻片一張，用記號筆分為兩格，于上角分別注明A、B字樣。 ⑵ 用毛細吸管取生理鹽水于玻片的兩格內(nèi)各加一滴。 ⑶ 用碘酒酒精棉球消毒耳垂或手指尖，采血1~2滴混入玻片上的生理鹽水中，迅速用牙簽混勻，制成血球懸液。 ⑷ 在兩格血球懸液中分別加抗A標準血清和抗B標準血清一滴，分別用牙簽兩端攪拌混勻，2~5分鐘后搖晃玻片，觀察結(jié)果。 【結(jié)果】 混合液由均勻紅色混濁狀逐漸變?yōu)橥该�，并出現(xiàn)大小不等的紅色凝集塊者即為紅細胞凝集；若混合液仍呈均勻混濁狀，無凝集塊，則表明紅細胞未發(fā)生凝集。血型鑒定試驗結(jié)果及鑒定見表 【注意事項】 ⑴ 試驗用載玻片要清潔，并務(wù)必注明A和B字樣。 ⑵ 待檢紅細胞懸液不宜過稀或過濃。 ⑶ 要及時觀察結(jié)果，以防時間過長使標本干涸而影響結(jié)果的觀察和判定。 做清潔 | 講授 ―――― 講授 板書 ―――― 講授 板書 示教 ―――――― 講授 板書 示教 ―――――― | 約10min ―――― 約30min ―――― 約40min ―――――― 約35min ―――――― 約5min |
小 結(jié) | 1、ABO血型鑒定的原理 2、血型鑒定的注意事項 3、ELISA的基本步驟 4、試管凝集的基本操作 |
復(fù) 習(xí) 思 考 題 、 作 業(yè) 題 | 思考題 1 常用的ELISA方法有哪些？ELISA雙抗夾心法的原理？ 2 什么叫對倍稀釋？什么叫凝集效價？ |
下 次 課 預(yù) 習(xí) 要 點 | 一、試管凝集的結(jié)果判定 二、對流免疫電泳 三、動物過敏試驗 |
實 施 情 況 及 分 析 |
