醫(yī)用化學-電子教材:第八章 比色分析法

第八章比色分析法

第一節(jié) 比色分析法的基本原理

   比色分析法（colorimetry analysis)是基于溶液對光的選擇性吸收而建立起來的一種分析方法，又稱為吸光光度法。

　　有色物質溶液的顏色深度與其濃度有關。有色物質溶液的濃度和液層的厚度越大，顏色越深。利用光學方法比較溶液顏色的深淺，可以測定溶液的濃度。

　　比色分析法具有簡單、快速、靈敏度高等特點，廣泛應用于微量組分的測定。通�？蓽y定含量在10^-1~10^-4mg·L^－1 的痕量組分。比色分析法如同其它分析一樣，也具有相對誤差較大（一般為1%~5%)的缺點。但對于微量組分的測定來說，由于絕對誤差很小，測定結果也是令人滿意的。在醫(yī)學學科中，比色分析法被廣泛應用于藥物分析、衛(wèi)生分析、生zxtf.net.cn/pharm/化分析等方面。

　　一、物質的顏色和光的關系

光是一種電磁波。自然光是由不同波長（400~760nm)的電磁波按一定比例組成的混合光，通過棱鏡可分解成紅、橙、黃、綠、青、藍、紫等各種顏色相連續(xù)的可見光譜。如把兩種光以適當比例混合而產生白光時，這兩種光的顏色互為補色，如圖8-1所示，直線兩端顏色的光互為補色。

圖8-1   光的互補色示意圖

　　當白光通過溶液時，如果溶液對各種波長的光都不吸收，溶液就沒有顏色。如果溶液吸收了一部分波長的光，則溶液呈現(xiàn)透過溶液后剩余部分光的顏色。例如，我們看到KMnO₄溶液在白光下呈紫紅色，就是因為白光透過溶液時，綠色光大部分被吸收，而其它各色的光都能透過。在透過的光中除紫紅色外都能兩兩互補成白色，所以KMnO₄溶液呈紫紅色。

表8-1  溶液的顏色與吸收光顏色的關系

　　同理，CuSO₄溶液能吸收黃色光，所以溶液呈藍色。由此可見，有色溶液的顏色是被吸收光顏色的補色。吸收越多，補色的顏色越深。比較溶液顏色的深淺，實質上就是比較溶液對它所吸收光的吸收程度。表8-1列出了溶液的顏色與吸收光顏色的關系。

　　二、朗伯－比爾（Lambert--Beer)定律

當一束平行單色光（只有一種波長的光)照射有色溶液時，光的一部分被吸收，一部分透過溶液（見圖8-2)。設入射光的強度為I₀。溶液的濃度為c，液層的厚度為b，透射光強度為I，則

   圖8-2  光吸收示意圖

   Kbc  (8-1)

　　上式中表示光線透過溶液時被吸收的程度，稱為吸光度（absorbance，A)或消光度（opticaldentsity，O.D.)。因此，上式又可寫為：

   A = Kbc(8-2)

　　上式為朗伯－比爾定律的數(shù)學表達式。它表示一束單色光通過溶液時，溶液的吸光度與溶液的濃度和液層厚度的乘積成正比。

　　式(8-2)中K為吸光系數(shù)， 當溶液濃度c和液層厚度b的數(shù)值均為1時，A＝K，即吸光系數(shù)在數(shù)值上等于 c 和 b 均為1時溶液的吸光度。對于同一物質和一定波長的入射光而言，它是一個常數(shù)。比色法中常把 稱為透光率（transmittace)，用 T 表示，透光率和吸光度的關系如下：

    (8-3)

　　當 c以質量濃度(g·L-1)為單位時，吸光系數(shù)用a表示，稱為質量吸光系數(shù)；當c以mol·L^-1為單位時，吸光系數(shù)稱為摩爾吸光系數(shù)，用ε表示，其單位是L·mol^-1·cm^-1。吸光系數(shù)越大，表示溶液對入射光越容易吸收，當c有微小變化時就可使A有較大的改變，因此測定的靈敏度較高。一般ε值在10³以上可進行比色分析。

　　如果測定某種物質對不同波長單色光的吸收程度，以波長為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖可得一條曲線，即物質對光的吸收曲線，可準確地描述物質對光的吸收情況。

　　圖8-3是幾種不同濃度KMnO₄溶液的吸收曲線，溶液在波長525nm附近的吸收最強，而對其它波長的光吸收較弱。光吸收程度最大處的波長叫做最大吸收波長，用λmax表示。不同溶液的KMnO₄溶液所得的吸收曲線，最大吸收波長都一致，只是相應的光被吸收的程度不同。

  圖8-3  KMnO₄溶液的吸收光譜曲線

　　吸收曲線可作為比色分析法中波長選定的依據(jù)，測定時一般選擇λmax的單色光作為入射光。這樣即使被測物質含量較低也可得到較大的吸光度，因而可使分析的靈敏度較高。

　　若所測定的溶液無色，可在測定前加入適當?shù)娘@色劑，通過與待測成分發(fā)生化學反應使溶液顯色即可測定此待測成分。

　　例8-1  已知在525nm處KMnO₄溶液的ε＝2235L·mol^-1·cm^-1，若用2cm比色皿，為使所測得的透光率介于20%－65%之間，溶液的濃度范圍是多少？

　　 解：若T＝20%

　　 則

　　 若T＝65%

　　 則    c= 4.19×10^-5(mol·L^-1)

因此溶液的濃度范圍是1.56×10^-4 ~ 4.19×10^-5mol·L^-1。

第二節(jié)　　比色分析法的測定方法和應用

　　一、目視比色法

　　用視力比較樣品溶液與標準品溶液的顏色深淺以確定物質含量的方法稱為目視比色法（visualcolorimetry)。

　　目視比色法的根據(jù)是：被測物質和已知濃度的標準物質在同樣條件下顯色，當兩溶液液層的厚度相等且顏色深度相同，　即吸收度相同時，則兩者的濃度相等。A_標＝A_樣，c_標L_標＝c_樣L_樣；當L_標＝L_樣時，c_標＝c_樣。

　　目視比色法常用的是標準系列法。

　　標準系列法（standard series method)是在納氏比色管中進行測定的。納氏比色管是一套由同種玻璃制成的大小形狀完全相同的平底玻璃管，有的具有玻塞或塑料塞。其容積有10mL、20mL、50mL、100mL等數(shù)種，管上具有標線以表示容量。比色管放在下面有反光鏡的比色管架上進行比色。

　　標準系列法的操作步驟如下：

先配制一個已知濃度的標準溶液，然后取一定量標準溶液按照由少至多的次序置于規(guī)格相同的比色管中，加入顯色劑并稀釋至一定體積，搖勻，成為一系列顏色由淺至深的標準色階。另取一定量的樣品溶液，用同樣方法，在同樣條件下使其顯色并稀釋至相同的體積，制成樣品比色液（其顏色深度應在標準色階范圍內)。然后將樣品比色液與標準色階逐一比較，如樣品比色液的顏色與標準色階中某一標準比色液的顏色相同，則此兩者的濃度相等。如樣品比色液的顏色介于某兩標準比色液的顏色之間，則可取它們濃度的平均值作為樣品比色液的濃度，再根據(jù)稀釋倍數(shù)求出樣品溶液的濃度: 

c_樣＝與樣品液等色度的標準管溶液濃度×稀釋倍數(shù)。

　　比色時可在自然光下進行。以漫射光為光源，各管受光情況一致，比色時可用平視法和俯視法，也可觀察反光鏡中各管顏色深淺的影像。我們常用的pH試紙就是采用的標準系列法。

　　標準系列法所用儀器簡單，操作方便，液層厚度大，適用于測定低濃度溶液，在野戰(zhàn)條件下應用廣泛。但比色時須先配制一系列標準色階，而標準色階不宜長期保存需臨時配制，同時目視比色也容易引入視覺誤差，影響分析結果的準確度。

二、分光光度法

（一)分光光度法

　　 分光光度法（spectrophotometry)是以鎢燈或氫燈光作光源，經單色光器分光后，以所需波長的單色光作入射光，通過測定溶液吸光度來求算溶液中被測物質含量的一種分析方法。所用的儀器稱為分光光度計（spectrophtometer)。分光光度計的型號很多，但其基本原理相似，主要部件表示如下：

   　　　 光源→單色器→吸收池→檢測器→放大器→指示器

　　1. 光源　可見分光光度計中，采用6~12V的鎢燈作光源，其最適宜的波長范圍是360~1000nm，為使光的強度穩(wěn)定，須用穩(wěn)壓裝置來穩(wěn)定電壓。紫外分光光度計中的光源為氫燈和鎢燈各一個，可按需要進行轉換。氫燈可用于200～400nm波長范圍的紫外分光光度法測定。

　  2. 單色器　分光光度計采用單色器來控制波長。它可以把連續(xù)波長的光通過棱鏡或光柵、狹縫和準直鏡等分解成所需波長的單色光。狹縫寬度應適中，狹縫太寬，單色光純度差；狹縫太窄，則光通量過小，影響測量靈敏度。

3. 吸收池  分光光度計中用來盛放溶液的容器稱為吸收池或比色皿。它是用無色透明、厚度均勻的玻璃制成的。其透光的兩面嚴格平行。同一系列的測定中，所用的比色皿必須配套，即同一配套比色皿盛有同一溶液在同一波長時測得的透光率不得越過0.5%。實驗時可根據(jù)溶液的濃度不同選擇0.5、1.0、2.0、3.0cm不同規(guī)格的比色皿。比色皿要保持清潔，透光面要注意保護，不得用手直接接觸或用粗糙的濾紙擦拭，以免劃傷表面，影響吸收程度，若外壁有液珠，應用濾紙吸干后再用擦鏡紙擦凈。紫外分光光度計的吸收池須用紫外光易通過的石英制造。

4. 檢測器  可見分光光度計中的檢測器一般用光電管，它是由一個陽極和一個用光敏感材料制成的陰極組成的真空二極管。當光照射到陰極時，金屬表面發(fā)射電子，流向電勢較高的陽極而產生電流。紫外分光光度計的光電管有紅敏（625～1000nm)和藍敏（200～625nm)兩只，可通過手柄轉換。光越強，陰極表面發(fā)射的電子越多，產生的光電流也越大。

5. 放大器和指示器   光電管產生的電流較弱，約為1×10^-6A，需經放大器放大后輸入指示器。指示器一般為微安電表、記錄器、數(shù)字顯示器和打印機等。在微安電表的標尺上同時刻有吸光度和透光率，如圖8-4所示。透光率刻度是等分的。因吸光度與透光率是負對數(shù)關系，所以吸光度刻度是不均勻的。

    圖8-4   吸光度與透光率標尺

圖8-5  72系列分光光度計光學系統(tǒng)示意圖

　　很多精密型分光光度計采用屏幕顯示吸收光譜、操作條件及各項數(shù)據(jù)，并可與計算機聯(lián)用，使測定更為方便，高級職稱考試網也擴大了分光光度法的應用范圍。圖8-5為72系列分光光度計的光學系統(tǒng)示意圖。由光源發(fā)出的連續(xù)輻射光線射于聚光鏡上，經平面鏡轉角90°反射到入射狹縫，射入單色器。入射光經過準直鏡反射后，以一束平行光射向背后鍍鋁的棱鏡而發(fā)生色散，從棱鏡色散后的光線經過準直鏡反射在出射狹縫上，再經過聚光鏡后進入比色皿。經溶液吸收后的透射光通過光門照射在光電管上轉換為光電信號，經過放大后輸入檢流計，由電表直接顯示出吸光度。

（二)可見分光光度法的測定方法

　　可見分光光度法常用于定量測定，最常用的測量方法有如下兩種。　

　　1. 標準曲線法

　　標準曲線法是分光光度法中最常用的方法。配制一系列不同濃度的標準溶液，用選定的顯色劑顯色。選用合適波長的入射光。測定時先以空白溶液調節(jié)透光率100%，然后分別測定標準系列的吸光度。以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標作圖得到一條通過原點的直線，叫做標準曲線（或稱工作曲線)。然后將被測溶液置于吸收池中，在相同條件下，測量其吸收度，并在標準曲線上查出其相應的含量。該方法對于經常性批量測定十分方便，采用此法時，應注意使標準溶液與被測溶液在相同條件下進行測量，且溶液的濃度應在標準曲線的線性范圍內。

在測定溶液吸光度時，為了消除溶劑或其它物質對入射光的吸收，以及光在溶液中的散射和吸收池界面對光的反射等與被測物質吸收無關的因素的影響，必須采用空白溶液（又稱參比溶液)作對照。常用的空白溶液有下列三種。

  （1)溶劑空白   當顯色劑及制備試液的其它試劑均無色，且溶液中除被測物外無其它有色物質干擾時，可用溶劑作空白溶液，這種空白溶液稱為溶劑空白。

  （2)試劑空白   若顯色劑有色，試樣溶液在測定條件下無吸收或吸收很小時，可用試劑空白進行校正。所謂試劑空白，是按顯色反應相同的條件加入各種試劑和溶劑(不加試樣溶液)后所得溶液，相當于標準曲線法中濃度為“0”的標準溶液。

  （3)試樣空白   當試樣基體有色(如試樣中混有其它有色離子)，但顯色劑無色，且不與試樣中被測成分以外的其它成分顯色時，可用試樣空白校正。所謂試樣空白，是指不加顯色劑但按顯色反應相同條件進行操作的試樣溶液。

　  2. 標準對照法

　　若僅對個別樣品進行測定，且A－ｃ曲線線性良好，可不作標準曲線而直接比較測定結果。

　　先配制一個與被測物質溶液的濃度相近的標準溶液，與被測溶液在相同條件下測定吸光度，根據(jù)下式可以計算。

A_標= K_標b_標c_標

A_測= K_測b_測c_測

　　由于使用同一波長的入射光，采用同樣的比色皿，測定同樣的物質，所以

K_標= K_測

b_標=b_測

因此   

即   

　�。ㄈ�)可見分光光度法的應用—鐵的含量測定

　　1. 原理  分析測定溶液中鐵的含量有硫氰酸鹽顯色法、磺基水楊酸法及鄰菲羅啉顯色法等各種方法�，F(xiàn)以磺基水酸楊法為例介紹鐵的含量測定。

在不同酸度下，F(xiàn)e^3＋和磺基水楊酸生成組成不同的配合物。若控制溶液pH值在8～11.5條件下顯色，可生成配位數(shù)為6的黃色三磺基水楊酸合鐵配合物。反應式如下：

Fe³⁺+3HSal^- [Fe(Sal)₃]^3-+3H⁺

　　溶液的最大吸收波長為420nm，因此可在420nm處進行測定。此方法適合于測定無大量Cu²⁺、Ca²⁺、Ni²⁺、Cr³⁺等離子存在的溶液中鐵離子的含量。

　　2、操作步驟

　　(1)標準曲線的繪制  稱取一定量硫酸鐵銨［NH₄Fe(SO₄)₂·12H₂O］， 用蒸餾水溶解，加適量硫酸酸化，配制成含F(xiàn)e^3＋0.1g·L^－1的標準溶液，再稀釋成含F(xiàn)e^3＋0.025mg·L^－1 的操作液。

　　取25mL容量瓶6只，編號后分別加入操作溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL，各加入10%NH₄Cl溶液2mL和10%磺基水楊酸溶液2mL，滴加氨水至溶液由紫紅色變?yōu)辄S色，并使氨水稍過量，然后用NH₄Cl－NH₃ 緩沖溶液稀釋至刻度，搖勻，以1號為空白，在420nm處依次測定吸光度。以Fe^3＋含量為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

　　(2)樣品的測定　取25mL容量瓶1只，準確加入經過處理的濃度在標準曲線范圍內的被測溶液，按上面標準系列配制的同樣方法加入等量的顯色劑和緩沖溶液，在相同的條件下測定被測溶液的吸光度，利用標準曲線找出樣品溶液的濃度，根據(jù)樣品溶液的稀釋倍數(shù)，求出樣品的含量。

　　例8-2  用鄰二氮菲測定鐵時，已知每毫升試液中含F(xiàn)e^2＋0.500μg，用2.00cm吸收池于508nm波長處的吸光度為0.198，計算三（鄰二氮菲)合鐵（Ⅱ)配合物的ε（508nm處)。

解：cFe²⁺ = ×10^-6×1000 = 8.96×10^-6(mol·L^-1)

因為 A = εbc

所以 ε= = 1.10×10^-4(mol·L^-1·cm^-1)

習  題

　　1. 為什么KMnO₄、CuSO₄溶液呈現(xiàn)不同的顏色，它們各吸收了哪些波長范圍的光？

　　2. 什么是質量吸光系數(shù)？什么是摩爾吸光系數(shù)？兩者關系如何？為什么要選用波長為λmax的單色光進行分光光度法測定？

　　3. 什么是吸收光譜？什么是標準曲線？各有什么實際應用？

　　4. 分光光度計主要由哪些部分組成？各起什么作用？

　　5. 已知透光率為20%和80%，分別計算其吸光度。已知吸光度為0.25和0.56，分別計算其透光率。

6. 已知某化合物的相對分子質量為251，將此化合物用乙醇作溶劑配成濃度為0.150mmol·L^-1的溶液，在480nm波長處用2.00cm吸收池測得透光率為39.8%，求該化合物在上述條件下的摩爾吸光系數(shù)ε和質量吸光系數(shù)α。

答案

　　5. A：0.70，0.097；T：56%，28%

　　6. ε= 1.33×10³mol·L^-1·cm^-1；α= 5.30L·g^-1·cm^-1