實驗三 細菌的人工培養(yǎng)
細菌的培養(yǎng)檢查法是很重要的微生物學實驗基本技術。當標本內(nèi)致病微生物含量少，或雜菌數(shù)量多，需用人工培養(yǎng)法加以分離、增殖，然后根據(jù)其特性加以鑒別并進行診斷。對藥品等制劑的無菌檢查及疫苗的制備也需進行細菌的人工培養(yǎng)。
細菌分離培養(yǎng)的基本條件包括接種用具(接種環(huán)、接種針)(圖3-1)、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)基，以及無菌室和超凈臺等。
圖3-1 接種環(huán)和接種針示意圖
一、培養(yǎng)基的配制
培養(yǎng)基是細菌的人工營養(yǎng)基質(zhì)。適宜的培養(yǎng)基必須含有細菌生長和繁殖所需的營養(yǎng)物質(zhì)，有合適的酸堿度，澄清且無菌。培養(yǎng)基按其物理性狀分為固體、半固體和液體培養(yǎng)基。按其用途，可分為基礎培養(yǎng)基、營養(yǎng)培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基及厭氧培養(yǎng)基等。
常用的培養(yǎng)基：
（一)肉湯培養(yǎng)基
肉湯培養(yǎng)基常用瘦牛肉制成，如無牛肉可用牛肉膏代替。
制法：
新鮮牛肉 500g
蛋白胨 10g
氯化鈉5g
蒸餾水 1000ml
1．將除去脂肪及筋膜的新鮮瘦牛肉切碎絞細，稱取500g加蒸餾水1000ml，混合后，置4℃冰箱過夜，除去液面上的浮油。過夜的目的是使牛肉的水溶性養(yǎng)料充分地滲透出來。
2．次日取出，煮沸30min。邊加熱邊攪拌，勿使肉渣沉底。用絨布過濾，并盡量擠凈肉渣中的液體。
zxtf.net.cn/hushi/3．在濾液中加1%蛋白胨、0.5%NaCL、0.1%K2HPO4，補足水分至1000ml。
4．冷至40～50℃時，用氫氧化鈉校正pH至7.8，煮沸10min(因肉浸液中部分碳水化合物經(jīng)加熱破壞，分解產(chǎn)酸而影響pH，加熱可使其穩(wěn)定)，然后補足失去水份，重新校正pH值。用脫脂棉過濾，濾液須澄清。
5．分裝于試管或三角燒瓶，塞好棉塞，高壓蒸氣滅菌。冷卻后取出。
6．無菌試驗：將肉湯置37℃溫育24h，確無細菌生長方可應用。
注：如用牛肉膏制肉湯培養(yǎng)基，配方如下：
牛肉膏 0.5g
蛋白胨 1g
氯化鈉 0.5g
蒸餾水 100ml
以上各成份混合高熱溶解后，即可調(diào)節(jié)pH，以下步驟同上。
（二)普通瓊脂培養(yǎng)基
普通瓊脂培養(yǎng)基是常用的固體培養(yǎng)基。瓊脂本身無營養(yǎng)，只是用以改變?nèi)鉁奈锢硇誀�。它是一種賦形劑，在98℃時融化，45℃左右凝固，通常肉湯中加入2％～3％瓊脂，融化后能在室溫下凝固形成固體，即為固體培養(yǎng)基。
成分：瓊脂 2～3g
肉湯培養(yǎng)基 100ml
方法：
1．取已制備好的肉湯培養(yǎng)基100ml，置于三角燒瓶中，加瓊脂2～3g加熱融化。
2．趁熱校pH至7.4～7.6。
3．未凝前分裝于試管和燒瓶中，加棉塞，高壓蒸氣滅菌。
4．試管趁熱斜置，冷凝后即為瓊脂斜面培養(yǎng)基，待燒瓶中瓊脂冷到50～60℃時傾注平板。即將瓶口或管口迅速通過火焰2～3次，微啟無菌平皿蓋，迅速傾注后，蓋皿，并在桌上輕輕移搖，使皿底鋪滿肉湯瓊脂，冷卻后即成瓊脂平板。
5．放4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
（三)半固體培養(yǎng)基
成分：
瓊脂 0.5g
肉湯培養(yǎng)基 100ml
方法：于100ml肉湯培養(yǎng)基中加入0.5g瓊脂，加熱融化后，校正pH7.4～7.6。分裝于小試管中(每管約2ml)，高壓蒸氣滅菌。滅菌后將試管直立，待冷凝后即成半固體培養(yǎng)基。4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
（四)血液瓊脂培養(yǎng)基
成份：
普通瓊脂培養(yǎng)基100ml
無菌脫纖維兔(或羊)血 10ml
方法：
1．將已滅菌的普通瓊脂培養(yǎng)基加熱融化，并冷至50℃左右。
2．以無菌操作加入脫纖維兔血或羊血于瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)混勻(注意勿產(chǎn)生氣泡)，然后分裝于滅菌試管或平皿中，制成血液瓊脂斜面或平板，放4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?nbsp;
二、細菌接種法
細菌的接種方zxtf.net.cn/rencai/法因各種培養(yǎng)基不同而異，常用的方法有平板、斜面、液體和半固體接種。
【材料】
1．瓊脂斜面、瓊脂平板、肉湯培養(yǎng)基。
2．葡萄球菌、大腸桿菌斜面培養(yǎng)物。
【方法】
（一)平板接種法
臨床上各種檢驗標本，如糞便、痰、膿液中�；煊卸喾N細菌。如欲檢查病人標本中是否有某種病原菌時，須先將各種細菌分離，獲得純菌培養(yǎng)物后才能進一步進行細菌的鑒定。瓊脂平板培養(yǎng)基因面積大，接種后可達到分離的目的，常稱分離培養(yǎng)法。平板接種法有多種，以下介紹平行劃線法(又稱連續(xù)劃線接種)及分區(qū)劃線法。
1．分區(qū)劃線法：如接種物中細菌極多時(如固體菌種、糞便等)則必須采用分區(qū)劃線法才能得到好結果(圖3-2)。
(1) 燒灼接種環(huán)，冷卻后，取1環(huán)接種菌液。
(2) 打開平板蓋，左手斜持平板(約45°角)，并靠近火焰，以免空氣中雜菌落入平板內(nèi)，右手握持已沾菌液的接種環(huán)在瓊脂平板一端連續(xù)平行劃線(約占平板面積的1/3)，為第1組線。劃線時，接種環(huán)與平板成30～40°，輕輕接觸平板，以腕力平行滑移接種環(huán)，注意避免將環(huán)嵌人瓊脂將其劃破。
(3) 轉動平板約70°，接種環(huán)燒灼滅菌冷卻后，從原接種處通過2～3條線，劃于另一個1/4的面積為第2組線。劃畢，接種環(huán)又燒灼滅菌，冷卻后同法劃出第3、4組線。
(4) 接種完畢，蓋上皿蓋，于皿底做好標記，將平板倒置(平板底面朝上)，置37℃培養(yǎng)18～24h，觀察結果。
2．平行劃線法：一般當接種物中細菌不太多時(如膿汁標本、液體培養(yǎng)物等)可以選用平行劃線法(圖3-3)。
圖3-2 分區(qū)劃線法（左)及菌落分布示意圖（右)
圖3-3 平板連續(xù)劃線法（左)及菌落分布示意圖（右)
【結果】
瓊脂平板表面散在分布兩種菌落，為圓形、光滑、濕潤、邊緣整齊，其中有金黃色色素的為金黃色葡萄球菌的菌落；另一種為大腸桿菌菌落。
（二)瓊脂斜面接種法
多用于純種細菌的增菌和保存菌種。
1．用滅菌接種針取細菌培養(yǎng)物少許。
2．拔出培養(yǎng)管棉塞，管口經(jīng)火焰滅菌，將沾有細菌的接種針從培養(yǎng)基中央刺入，沿原穿刺線拔出。
3．再將接種針自下而上在瓊脂上平行劃線(圖3-4)。
4．接種后，管口在火焰上滅菌，塞回棉塞，接種環(huán)滅菌。
5．在試管壁近管口處做好標記，置37℃培養(yǎng)18～24h，觀察結果。
（三)肉湯接種法
用于增菌。
1．滅菌接種環(huán)取細菌培養(yǎng)物少許。
2．以無菌操作將沾有細菌的接種環(huán)伸入肉湯管中，將環(huán)上細菌輕輕研磨于接近液面的管壁上，然后將試管稍傾斜，使肉湯碰及細菌，將細菌帶入培養(yǎng)基中(圖3-5)。
3．接種后管口滅菌，塞回棉塞，接種環(huán)滅菌，并做好標記，置37℃培養(yǎng)18～24h，觀察結果。
（四)半固體接種法(穿刺接種法)
用于觀察細菌有無動力。
半固體接種是用接種針，無菌操作方法同前。將取有細菌的接種針從培養(yǎng)基的中央刺入，沿原穿刺線拔出，注意在刺入與拔出時不可晃動接種針(圖3-6)。
圖3-4 斜面接種法 圖3-5 液體培養(yǎng)基接種法 圖3-6 穿刺培養(yǎng)法
接種后做好標記，置37℃培養(yǎng)18～24h，觀察結果。
（五)傾注平板法
用于飲水、牛乳、尿液、藥物等標本的細菌計數(shù)。
方法是將經(jīng)滅菌生理鹽水適量稀釋(通常作10-1～10-5稀釋)的標本lml，置于滅菌平皿內(nèi)。注入10～15ml已融化并冷至50℃左右的適宜培養(yǎng)基(圖3-7)，凝固后，將平板倒置于37℃培養(yǎng)18～24h，計算菌落數(shù)。
圖3-7 傾注平板法
（六)厭氧培養(yǎng)法
1．生物學法：如肉渣培養(yǎng)基(庖肉培養(yǎng)基)，因肉渣中含有不飽和脂肪酸及谷胱甘肽，能吸收培養(yǎng)基中的氧，使氧化還原電位下降，故適于厭氧菌培養(yǎng)。同時用石蠟凡士林封閉液面，可隔絕空氣中的游離氧繼續(xù)進入培養(yǎng)基，形成更為良好的厭氧條件，并可借石蠟凡士林層是否上移指示該菌是否產(chǎn)氣。
另外可利用需氧菌與厭氧菌共生的原理，將需氧菌和厭氧菌分別接種在同一瓊脂平板上，然后將瓊脂平皿用融化石蠟密封，放溫箱內(nèi)培養(yǎng)，需氧菌生長時消耗環(huán)境中的氧氣而有利于厭氧菌生長。
2．化學法：焦性沒食子酸的堿性溶液能迅速吸收氧氣，生成棕褐色的焦性沒食子橙，造成厭氧環(huán)境。此法適用于單個瓊脂平皿的培養(yǎng)。方法是將厭氧菌劃線接種于血瓊脂平皿，取無菌方形玻璃板一塊或培養(yǎng)皿蓋，鋪上一薄層滅菌脫脂棉或紗布，將1g焦性沒食子酸放在其上，滴加10%NaOH溶液約2ml于焦性沒食子酸上，迅速將培養(yǎng)平皿倒置于玻璃板或培養(yǎng)皿蓋上，周圍以融化的石蠟或膠泥密封，將其置37℃培養(yǎng)24～48h后取出觀察。
3．物理方法：如用厭氧缸或厭氧工作站，將接種的平皿和試管放入特制的厭氧缸或厭氧工作站內(nèi)，用抽氣機抽去空氣再充入氫、氮或二氧化碳，于37℃培養(yǎng)。此法適用于大量厭氧菌培養(yǎng)。又如高層瓊脂法，是在試驗中加入占其高度約3/5的無菌瓊脂培養(yǎng)基，水浴融化后接種細菌，混勻后，直立待其凝固，于37℃培養(yǎng)。
三、細菌培養(yǎng)性狀觀察
（一)瓊脂平板上菌落觀察
菌落是經(jīng)分離培養(yǎng)后由單個細菌生長繁殖形成的集團。不同細菌的菌落各有特點，觀察時應選擇比較分散的菌落，并注意以下幾個方面：大小、形狀、邊緣、表面、透明度、顏色、溶血性等。
（二)肉湯培養(yǎng)基中細菌生長現(xiàn)象的觀察
肉湯在未接種細菌前是澄清的，接種細菌后如有生長，有三種形式：
1．混濁生長：液體變混濁。
2．膜狀生長：液體澄清，表面有一薄層菌膜。
3．沉淀生長：液體澄清，管底有沉淀物。
（三)半固體中細菌生長觀察
半固體可觀察細菌有無動力，無動力菌沿穿刺線生長，培養(yǎng)基澄清。有動力菌，穿刺線模糊不清，培養(yǎng)基混濁。
