生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)-第二篇:第十二章

第十二章 神經(jīng)系統(tǒng)

第一節(jié)  神經(jīng)干動(dòng)作電位及其傳導(dǎo)速度的測(cè)定

[實(shí)驗(yàn)?zāi)康腯

掌握神經(jīng)干標(biāo)本制備、動(dòng)作電位（actionn potential ,AP)及其傳導(dǎo)速度的測(cè)定與計(jì)算方法，了解其測(cè)定原理與相關(guān)儀器使用方法；觀察、識(shí)別蟾蜍坐骨神經(jīng)干雙相和單相動(dòng)作電位，測(cè)定其傳導(dǎo)速度；分析機(jī)械損傷或局麻藥、低溫對(duì)神經(jīng)干AP及其傳導(dǎo)速度的影響；  

[實(shí)驗(yàn)對(duì)象]

 蟾蜍或青蛙。 

[藥品、器材]

 PCLAB生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)一套、神經(jīng)標(biāo)本盒、蛙類(lèi)手術(shù)器械、濾紙、棉球、縫合線(xiàn)、任氏液、燒杯、滴管等。

[觀察指標(biāo)]

 蟾蜍或青蛙坐骨神經(jīng)干雙相、單相動(dòng)作電位及其傳導(dǎo)速度

    [方法、步驟]

(1)制備坐骨神經(jīng)干標(biāo)本

破壞腦脊髓：取蟾蜍一只用自來(lái)水沖洗干凈，左手握蟾蜍，小指和無(wú)名指夾住后肢，拇指按壓背部，中指放在胸腹部，用食指下壓頭部前端使頭前俯(圖12-1)，右手持金屬探針由枕骨沿正中線(xiàn)向脊柱端觸劃，當(dāng)觸到凹陷處即枕骨大孔處，可將探針由此垂直刺入皮膚入枕骨大孔后，將針折向前方插入顱腔并左右攪動(dòng)搗毀腦組織，而后退針至刺入點(diǎn)皮下，針尖向后刺入脊椎管搗毀脊髓，當(dāng)四肢松軟、呼吸消失則表示腦脊髓完全毀壞，否則應(yīng)按上法重復(fù)操作。

圖12-1  破壞蟾蜍腦脊髓的方法

剪除軀干上部及內(nèi)臟： 在骶髂關(guān)節(jié)水平以上lcm處用粗剪刀剪斷脊柱，左手執(zhí)鑷子夾緊脊柱斷端(骶骨端)并稍向上提起，使蟾蜍的頭與內(nèi)臟自然下垂，右手持大剪刀，沿兩側(cè)將蟾蜍的頭、前肢和內(nèi)臟全部剪除并棄置污物桶內(nèi)(圖12-2)，僅保留后肢，腰背部脊柱及由它發(fā)出的坐骨神經(jīng)叢(呈灰白色)。

 圖12-2   剪除軀干上部及內(nèi)臟

去皮：左手持粗鑷夾住脊柱斷端，不要夾住或觸及神經(jīng)，右手捏住其上的皮膚邊緣向下撕去背部的皮膚后，剪去大小腿的全部皮膚。將手和用過(guò)的剪子、鑷子、蛙板等全部手術(shù)器械用自來(lái)水沖洗凈，再行以下操作。

分離兩腿：沿正中線(xiàn)將脊柱剪分為兩半（勿損傷坐骨神經(jīng))，并從恥骨聯(lián)合中央剪開(kāi)兩側(cè)大腿，使兩腿完全分離，將兩腿浸于盛有任氏液的燒杯中。

游離坐骨神經(jīng)：取一后肢，腹面向上認(rèn)清坐骨神經(jīng)及其走向后，在靠近脊柱處穿線(xiàn)結(jié)扎，并在結(jié)扎線(xiàn)上剪斷神經(jīng)，線(xiàn)頭保留約1cm。用鑷子夾住線(xiàn)頭，提起坐骨神經(jīng)進(jìn)行分離，沿坐骨神經(jīng)溝(股二頭肌與半膜肌之間的裂隙處)分離出大腿部的坐骨神經(jīng)并用玻璃針輕輕勾起坐骨神經(jīng)干，剪斷所有分支，分離至月國(guó)窩處可見(jiàn)有兩條分支，即脛神經(jīng)和腓神經(jīng)。剪去任一分支(腓神經(jīng)較淺，易分離，常保留)，繼續(xù)分離留下的另一分支(也可兩支都分離)，直至腳趾端。用線(xiàn)結(jié)扎，在結(jié)扎線(xiàn)的遠(yuǎn)端，剪斷腓神經(jīng)，也保留一小段線(xiàn)頭(約1cm)，全長(zhǎng)須在8厘米以上。將此完全游離的坐骨神經(jīng)干置于盛有任氏液的燒杯中備用。按同樣的方法，分離另一根坐骨神經(jīng)干備用。

（2)連接實(shí)驗(yàn)裝置（圖12-3)

將引導(dǎo)電極、刺激輸出線(xiàn)分別插入計(jì)算機(jī)主機(jī)輸入2、刺激輸出并與神經(jīng)標(biāo)本盒相應(yīng)電極相連。

（3)用任氏液棉球擦拭干凈神經(jīng)標(biāo)本盒全部電極，鑷子夾住神經(jīng)干標(biāo)本兩頭的線(xiàn)頭，將標(biāo)本安放在電極上（粗端放在刺激電極上，細(xì)端放在引導(dǎo)電極上)。

（4)觀察坐骨神經(jīng)干雙相動(dòng)作電位。開(kāi)機(jī)，雙擊PCLAB圖標(biāo)進(jìn)入生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)。按前面介紹的使用方法調(diào)試好儀器后，點(diǎn)擊“刺激”按鈕，系統(tǒng)開(kāi)始采樣，適當(dāng)調(diào)整各通道放大倍數(shù)及X、Y軸壓縮比，即可產(chǎn)生雙向動(dòng)作電位。如改刺激參數(shù)為刺激個(gè)數(shù)為2，并適當(dāng)增加時(shí)間間隔至1秒，即可觀察到神經(jīng)干的2個(gè)雙向動(dòng)作電位。

 圖12-3 實(shí)驗(yàn)裝置示意圖

（5)測(cè)定神經(jīng)興奮傳導(dǎo)速度。抬起放大器面板上，S—R按鈕，并調(diào)整第四通道放大倍數(shù)，可在第四通道上觀察到比第二通道在時(shí)間上稍有延遲的第二個(gè)動(dòng)作電位，同時(shí)測(cè)定神經(jīng)興奮傳導(dǎo)速度（V= d/T，V：神經(jīng)干AP傳導(dǎo)速度；d：R₁與R₂之間的距離；T：兩個(gè)AP起點(diǎn)的間隔時(shí)間)：①測(cè)量正常AP傳導(dǎo)速度， ②將標(biāo)本置于4℃任氏液中浸泡5分鐘后，觀察AP變化測(cè)定其傳導(dǎo)速度。

（6)調(diào)換標(biāo)本方向，觀察AP有無(wú)變化。

（7)保持刺激電極與引導(dǎo)電極間距離不變，改變兩引導(dǎo)電極（R₁與 R₂)間距離觀察雙相AP變化。

 （8)對(duì)調(diào)兩引導(dǎo)電極的位置，觀察雙相AP變化。

（9)在兩引導(dǎo)電極之間滴一滴普魯卡因，觀察AP波形變化。

（10)用鑷子將兩引導(dǎo)電極之間的神經(jīng)夾傷，觀察AP波形的改變。

（11)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，選取“文件”下的打印，打印實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

[注意事項(xiàng)]

（1)神經(jīng)干應(yīng)盡可能分離得長(zhǎng)一些，全長(zhǎng)須在8cm以上。

（2)神經(jīng)干分離過(guò)程中慎勿損傷神經(jīng)組織，以免影響實(shí)驗(yàn)效果。

（3)神經(jīng)干兩端要用細(xì)線(xiàn)扎住，然后浸于任氏液中備用。

（4)實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)蓋上神經(jīng)標(biāo)本盒的盒蓋并接地，以防干擾與神經(jīng)干燥。

（5)坐骨神經(jīng)干標(biāo)本可直接從剪斷軀干開(kāi)始制備。

（6)指導(dǎo)圖12-3中S₁  S₂:刺激電極；R₁R₂：引導(dǎo)電極。

[思考題]

（1)神經(jīng)干雙相和單相AP產(chǎn)生、傳導(dǎo)和引導(dǎo)原理如何?本實(shí)驗(yàn)采用方法是細(xì)胞外記錄方法，此外還有何種方法記錄AP？

（2)神經(jīng)干AP與單一神經(jīng)纖維的AP有何區(qū)別?何謂神經(jīng)干復(fù)合AP？

（3)為什么一般情況下記錄到的雙相動(dòng)作電位的波形是不對(duì)稱(chēng)的?

（4)低溫、標(biāo)本倒向、改變兩引導(dǎo)電極間距離、對(duì)調(diào)兩引導(dǎo)電極的位置、改變刺激電極和引導(dǎo)電極間的距離、用藥物阻斷或機(jī)械損傷等分別對(duì)神經(jīng)干AP的波形、傳導(dǎo)速度有何影響？為什么？

 （5)何謂雙向AP、單向AP，二者有何區(qū)別？本實(shí)驗(yàn)采用什么方法引導(dǎo)觀察單向AP，另有什么方法引導(dǎo)出單向AP？

  高治平   劉建芝

第二節(jié)  減壓神經(jīng)放電與動(dòng)脈血壓變化

[實(shí)驗(yàn)?zāi)康腯

學(xué)習(xí)哺乳類(lèi)動(dòng)物在體神經(jīng)干動(dòng)作電位的引導(dǎo)和血壓直接測(cè)量方法，觀察機(jī)械刺激、電刺激、藥物及神經(jīng)體液因素對(duì)家兔血壓的影響，分析減壓神經(jīng)放電的頻率、幅度、聲音與動(dòng)脈血壓的變化的相互關(guān)系。

[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物] 

家兔。

[藥品、器材] 

生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)一套、血壓換能器1個(gè)、手術(shù)器械一套、動(dòng)脈插管1個(gè)、兔手術(shù)臺(tái)1個(gè)、雙極銀絲引導(dǎo)電極1根、鐵支柱2個(gè)、試管夾、雙凹夾2個(gè)、滴管1支、玻璃分針1個(gè)、25％氨基甲酸乙酯（或3%戊巴比妥鈉)1瓶、生理鹽水1瓶、肝素生理鹽水1瓶、液體石蠟(加溫38—40℃)1瓶、1：10000去甲腎上腺素1瓶、利血平注射液1支（或1：10000乙酰膽堿等藥)、50ml注射器1個(gè)、1ml注射器2個(gè)、10ml注射器1個(gè)、紗布、紗帶、縫合線(xiàn)等。

[觀察指標(biāo)]

（1)兔減壓神經(jīng)放電頻率、幅度，監(jiān)聽(tīng)放電聲音（類(lèi)似火車(chē)開(kāi)動(dòng)樣的轟隆聲)。

（2)兔動(dòng)脈血壓。

[方法、步驟]

（1)連接實(shí)驗(yàn)裝置：將血壓換能器、生物電引導(dǎo)電極與生物信息采集處理系統(tǒng)相連接。

（2)用50ml注射器抽取肝素生理鹽水，從三通側(cè)管注入血壓換能器及其相連接的動(dòng)脈插管內(nèi)，排盡管內(nèi)空氣。

（3)麻醉與固定 ：秤量動(dòng)物體重，用20％氨基甲酸乙酯（1g／kg)緩慢注入耳緣靜脈，待動(dòng)物麻醉后，將其仰臥（前肢背位交叉)固定于兔手術(shù)臺(tái)上。

（4)分離減壓神經(jīng)、血管、氣管

   頸前部備皮后，頸部正中切開(kāi)4-6cm，用止血鉗分離皮下組織，分開(kāi)胸舌骨肌，暴露氣管，用左手拇指和食指捏住右側(cè)切口的皮膚和肌肉，其余三指從皮膚外面略向上向外翻，暴露與氣管平行的血管神經(jīng)束，束內(nèi)有頸總動(dòng)脈、迷走神經(jīng)(最粗)、交感神經(jīng)(次之)和減壓神經(jīng)(最細(xì))。仔細(xì)辨認(rèn)三根神經(jīng)，用玻璃分針將減壓神經(jīng)從血管神經(jīng)束中分離出來(lái)1.5-2cm，分離須干凈，動(dòng)作要輕柔細(xì)致，并用溫生理鹽水浸濕過(guò)的細(xì)絲線(xiàn)在其下方穿過(guò)備用。用同樣方法依次分離游船右側(cè)交感神經(jīng)、迷走神經(jīng)、氣管、兩頸總動(dòng)脈，分別穿線(xiàn)備用。

（5)做人工皮兜（也可不做)

用血管鉗把神經(jīng)周?chē)�的皮膚提起，做成人工皮兜，向皮兜內(nèi)滴入38—40℃液體石蠟浸泡神經(jīng)，保護(hù)神經(jīng)以防干燥和溫度降低，另外，液體石蠟還具有絕緣作用。 

（6)行氣管插管、左頸總動(dòng)脈插管術(shù)，記錄血壓。

氣管插管：在甲狀軟骨下2—3cm，兩氣管環(huán)間做倒“T”形切口，向下插入氣管插管，用棉線(xiàn)結(jié)扎固定，便于呼吸通暢。

動(dòng)脈插管：結(jié)扎左頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端后（保留結(jié)扎線(xiàn))，在其近心端夾一動(dòng)脈夾，動(dòng)脈夾與結(jié)扎之間應(yīng)相距3cm左右。在結(jié)的下方用眼科剪作一1/2斜切口，向心臟方向插入已灌滿(mǎn)肝素生理鹽水的動(dòng)脈插管，扎緊插管尖端并固定于其側(cè)管，以防插管滑出，松開(kāi)動(dòng)脈夾觀察插管內(nèi)液面是否有隨心跳波動(dòng)。

（7)用玻璃分針輕輕挑起減壓神經(jīng)放置于引導(dǎo)電極上，將電極固定于支架上，調(diào)節(jié)好引導(dǎo)電極于合適的位置，使電極與神經(jīng)良好接觸，電極不能與周?chē)�組織接觸，但又不過(guò)度牽拉神經(jīng)。然后，將接地線(xiàn)夾在附近切開(kāi)的組織上。

   （8)開(kāi)機(jī)，雙擊生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)圖標(biāo)。按使用方法調(diào)試準(zhǔn)備好儀器后，點(diǎn)擊“開(kāi)始”按鈕，系統(tǒng)開(kāi)始采樣，適當(dāng)調(diào)整各通道放大倍數(shù)及X、Y軸壓縮，在觀察到理想的波形曲線(xiàn)時(shí)。（注意：應(yīng)聽(tīng)到清晰的轟隆轟隆的神經(jīng)放電比聲音，如聲音太小不清楚，可調(diào)節(jié)音箱音量旋鈕，放大音量，或加大第一通道的放大倍數(shù)，一般在10000至20000倍即可)。

（9)觀察正常血壓曲線(xiàn)：辨認(rèn)血壓波的一級(jí)波和二級(jí)波，有時(shí)可見(jiàn)三級(jí)波。一級(jí)波（心搏波)由心室舒縮引起血壓波動(dòng)，心縮時(shí)上升，心舒時(shí)下降，頻率與心率一致；二級(jí)波（呼吸波)，是呼吸運(yùn)動(dòng)引起的血壓波動(dòng)，吸氣時(shí)，血壓先降后升，呼吸時(shí)血壓先升后降；三級(jí)波（不常出現(xiàn))可能是血管運(yùn)動(dòng)中樞緊張性的周期性變化的結(jié)果。

（10)觀察分析正常減壓神經(jīng)放電集群的特點(diǎn)，并監(jiān)聽(tīng)其聲音。

（11)向下?tīng)坷�右頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端結(jié)扎線(xiàn)5—10秒，觀察減壓神經(jīng)放電頻率、幅度、聲音與血壓變化相互關(guān)系。

（12)從耳緣靜脈注射1：10000去甲腎上腺素0．2 -0．3m1，觀察減壓神經(jīng)放電的頻率、幅度、聲音與血壓變化相互關(guān)系。

（13)從兔耳緣靜脈注射利血平2m1或1：10000乙先膽堿0.3 m1，觀察減壓神經(jīng)放電頻率、幅度聲音與血壓變化相互關(guān)系。

（14)用動(dòng)脈夾夾閉右頸總動(dòng)脈5—10秒，觀察減壓神經(jīng)放電頻率、幅度、聲音與血壓變化相互關(guān)系（注：從此步開(kāi)始，如操作不便，可取下減壓神經(jīng)，僅觀察下列因素對(duì)血壓的影響)。

（15)電刺激減壓神經(jīng)（刺激幅度：1—2v，刺激時(shí)間：5-10s)，觀察血壓的變化。結(jié)扎剪斷之，分別刺激中樞端與外周端，觀察血壓的變化，為什么？

（16)電刺激迷走神經(jīng)（刺激幅度：1—2v，刺激時(shí)間：5-10s)，觀察血壓的變化。結(jié)扎剪斷之，分別刺激中樞端與外周端，觀察血壓的變化，為什么？

（17)結(jié)扎剪斷和刺激交感神經(jīng)對(duì)兔耳血管網(wǎng)的影響。比較觀察左右兩耳血管網(wǎng)的數(shù)目和充血情況，然后結(jié)扎并于近心端剪斷左交感神經(jīng)，稍等片刻，比較觀察左耳血管網(wǎng)與右耳有何不同？然后電刺激左交感神經(jīng)頭端（外周端)觀察其血管網(wǎng)的變化，稍侯片刻，再觀察左耳血管網(wǎng)又有何變化？為什么？

（18)從右頸總動(dòng)脈緩慢放血20ml-50ml（或維持血壓在40mmHg一定時(shí)間)，觀察右耳血管網(wǎng)（及血壓)的變化。然后快速補(bǔ)液（37℃生理鹽水或5%的葡萄糖溶液)觀察血壓和右耳血管網(wǎng)及其顏色的變化。

[注意事項(xiàng)]  找準(zhǔn)減壓神經(jīng)是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。

（1)麻醉不宜過(guò)淺，否則動(dòng)物掙扎，拉斷神經(jīng)或產(chǎn)生肌電干擾。

（2)減壓神經(jīng)纖細(xì)，分離、勾起神經(jīng)時(shí)，動(dòng)作要輕柔細(xì)致，切勿盲目牽拉，以免損傷神經(jīng)，影響放電。

（3)分離要干凈，神經(jīng)上不能附有結(jié)締組織膜。引導(dǎo)電極與神經(jīng)干須緊密接觸并懸空，避免觸碰周?chē)�組織，影響放電。

（4)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，可滴少量38—40℃的液體石蠟于減壓神經(jīng)起到絕緣和防止干燥的作用。

（5)引導(dǎo)電極兩極間距為2mm左右，并要干燥，以防短路而影響電位記錄。

（6)引導(dǎo)電極的導(dǎo)線(xiàn)要用屏蔽線(xiàn)，方可抗干擾。電極導(dǎo)線(xiàn)不宜過(guò)長(zhǎng)，避免與電源線(xiàn)或其它干擾源的導(dǎo)線(xiàn)相交，以防產(chǎn)生干擾。

（7) 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，如發(fā)現(xiàn)電位幅度逐漸減小或50HZ干擾信號(hào)，應(yīng)檢查神經(jīng)是否干燥，動(dòng)物局部和全身溫度是否過(guò)低等，適當(dāng)給予相應(yīng)處理。

（8)實(shí)驗(yàn)步驟10-13，均必須待減壓神經(jīng)放電及血壓灰復(fù)正常后，方可進(jìn)行下一步驟。

[思考題]

（1)夾閉、牽拉頸總動(dòng)脈后，減壓神經(jīng)放電、血壓各有何變化? 為什么?  

（2)注入去甲和利血平后，減壓神經(jīng)放電、血壓各有何變化? 為什么?  

（3)觀察心縮期與心舒期血壓和減壓神經(jīng)放電的變化，分析減壓神經(jīng)放電與血壓的相互關(guān)系。

（4)根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析斷減壓神經(jīng)是傳入神經(jīng)還是傳出神經(jīng)，并說(shuō)明減壓反射的調(diào)節(jié)方式、調(diào)節(jié)過(guò)程與生理意義。

（5)本實(shí)驗(yàn)或機(jī)能學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中所采用的動(dòng)脈血壓測(cè)量法是屬直接測(cè)量法，還是屬間接測(cè)量法？

（6)請(qǐng)分析電刺激內(nèi)臟大神經(jīng)時(shí)，血壓變化如何？為什么？

  高治平  劉建芝

第三節(jié)  香煙的毒性作用

   ［實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/b>

觀察煙對(duì)小鼠的毒性作用，以明確吸煙對(duì)人體的危害。

  ［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物］

小鼠。

  ［藥品、器材］

水煙斗、火柴、1.0ml注射器、10．0m1量筒，香煙、生理鹽水。

  ［觀察指標(biāo)］

小鼠的肌肉活動(dòng)、呼吸、末梢循環(huán)情況，最后是否死亡。

  ［方法、步驟］

（1)量筒量取生理鹽水4．0m1置于煙斗內(nèi)，搖勻后，先用注射器抽取1．0ml液體(對(duì)照組用)，然后，將香煙插于水煙斗上并點(diǎn)燃，于煙斗嘴處用洗耳球抽吸促使繼續(xù)燃燒(如圖5-1)，使煙霧經(jīng)煙斗內(nèi)溶液過(guò)濾，此時(shí)，煙霧內(nèi)部分水溶性毒物如尼古丁(煙鹼)等，即溶于水中。

（2)取小鼠2只，觀察正常情況后，甲鼠腹腔注射煙過(guò)濾液0.5m1，乙鼠則腹腔注射吸煙前煙斗內(nèi)溶液0．5m1做對(duì)照，逐步觀察并比較兩小鼠的表現(xiàn)(肌肉活動(dòng)、呼吸、末梢循環(huán))。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果填入下表：

表5-1 香煙濾液對(duì)小鼠的毒性作用

   ［思考題］

含有尼古丁的煙過(guò)濾液為什么可使小鼠出現(xiàn)一系列中毒表現(xiàn)?

圖5-1 a煙斗嘴  b生理鹽水  c點(diǎn)燃的香煙

（黃紅林 謝志忠)

第四節(jié)  有機(jī)磷酸酯類(lèi)的中毒與解救

   ［實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?

(1)觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在有機(jī)磷酸酯類(lèi)中毒時(shí)的癥狀，以及中毒時(shí)血液膽堿酯酶活力的抑制情況。

(2)根據(jù)阿托品、解磷定對(duì)有機(jī)磷酸酯類(lèi)中毒的解救效果及對(duì)血液膽堿酯酶活力的影響，分析兩藥的解毒原理。

  ［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物］

家兔2只，性別不拘。

  ［藥品、器材］

30％精制敵百蟲(chóng)溶液、0.2％高級(jí)職稱(chēng)考試網(wǎng)硫酸阿托品溶液、2.5％解磷定溶液、二甲苯。家兔固定箱、注射器、預(yù)先加草酸鉀的試管、試管架、刀片、干棉球、瞳孔尺與木夾。

  ［參考指標(biāo)］

見(jiàn)表4-1。

   ［方法、步驟］

  (1)取家兔2只，以甲、乙編號(hào)，稱(chēng)其體重，觀察活動(dòng)情況和呼吸(頻率、幅度、是否困難等)

、瞳孔大小、唾液分泌、大小便、肌張力、有無(wú)震顫等，分別加以記錄。

 &nbs執(zhí)業(yè)藥師p; (2)將2只家兔分別固定于箱內(nèi)，以蘸有二甲苯的棉球涂擦耳殼，使血管擴(kuò)張。

當(dāng)充血明顯時(shí)，用刀片切割耳靜脈(切口不要過(guò)大、過(guò)深)，讓血液自然流出，滴入預(yù)先置有少量草酸鉀結(jié)晶的試管中，立即搖勻，供測(cè)定血液膽堿酯酶活力之用，如取血后切口流血不止，可用干棉球按住，再夾上木夾止血。

   (3)將2只家兔同樣給予有機(jī)磷酸酯類(lèi)藥物。腹腔注射30％敵百蟲(chóng)1.0mg/Kg，密切注意給藥后家兔各項(xiàng)生理指標(biāo)的變化，加以記錄，中毒癥狀明顯后，再按上述方法取血，留待膽堿酯酶活力測(cè)定。

   (4)立即給甲兔由耳緣靜脈注射0.2％硫酸阿托品溶液1.0 ml／kg，給乙兔由耳緣靜脈注射2.5％解磷定2.0ml／kg，然后每隔5min，再檢查各項(xiàng)生理指標(biāo)1次，觀察2只家兔的情況有無(wú)好轉(zhuǎn)，特別注意甲兔和乙兔的區(qū)別。待有關(guān)中毒癥狀明顯消減以后，再由2只家兔的靜脈取血，測(cè)定血液膽堿酯酶活力。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果按表4-1的內(nèi)容逐項(xiàng)填寫(xiě)。

表4-1  有機(jī)磷酸酯類(lèi)中毒與解救的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

  ［注意事項(xiàng)］

(1)敵百蟲(chóng)屬于劇毒類(lèi)殺蟲(chóng)劑，且可從皮膚吸收，如與手等接觸后，應(yīng)立即用水清洗。

(2)給家兔實(shí)施腹腔注射敵百蟲(chóng)后，15min時(shí)仍未出現(xiàn)中毒癥狀，可再追加1／3劑量的敵百蟲(chóng)溶液。

(3)本實(shí)驗(yàn)為分析阿托品和解磷定的作用機(jī)制而設(shè)。應(yīng)切記，在臨床實(shí)際中，須將阿托品與解磷定配合使用，才能獲得最好的解毒效果。

  ［思考題］

試根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分析有機(jī)磷酸酯類(lèi)的中毒機(jī)制及阿托品和解磷定的解毒原理。

附：全血膽堿酯酶活力的比色測(cè)定法

一、原理

血液膽堿酯酶催化乙酰膽堿的水解。在一定條件下，水解的乙酰膽堿量與酶的活力有關(guān)。故加入一定量的乙酰膽堿，使之與血液作用后，測(cè)定剩余乙酰膽堿之量，便可知已水解的乙酰膽堿量，從而測(cè)出膽堿酯酶的活力。

剩余乙酰膽堿的測(cè)定是利用乙酰膽堿與羥胺作用生成羥肟酸，后者在酸性條件下又與三價(jià)鐵離子作用，生成紅棕色的羥肟酸鐵絡(luò)合物。

二、器材

試管、試管架、吸管、恒溫水浴、光電比色計(jì)。

三、試劑

(1)2／15mol／L磷酸氫二鈉溶液：稱(chēng)取Na��2HPO��4·12H��2O 23.87g，用蒸餾水溶解并稀釋至500m1。

(2)2／15mol／L 磷酸二氫鉀溶液：稱(chēng)取KH��2P0��4  9.08g，用蒸餾水溶解并稀釋至500 ml。

(3)pH7.2磷酸鹽緩沖液：取2／15 mol／L磷酸氫二鈉溶液72ml，與2／15mol／L磷酸氫二鉀溶液28ml混和即成。

(4)0.1mol／LpH4.5醋酸鹽緩沖液：先由每升冰醋酸5.78m1之水溶液28ml和每升含醋酸鈉(不含結(jié)晶水)8.20g之水溶液22ml混和，成為0.1 mol／L pH4.5之醋酸鹽緩沖液，再用蒸餾水稀釋到l／100倍。

(5)0.07mol/L乙酰膽堿底物貯存液：快速稱(chēng)取氯化乙酰膽堿0.127g(或溴化乙酰膽堿0.158g)，溶于0.001mol／L PH4.5醋酸鹽緩沖液10m1中。在冰箱中可保存4周。

(6)0.007 mol／L乙酰膽堿底物應(yīng)用液：臨用前取0.07 mol／L乙酰膽堿底物貯存液，用pH7.2磷酸鹽緩沖液稀釋到1／10倍。

(7)堿性羥胺溶液：臨用前20分鐘內(nèi)取等量的14％氫氧化鈉溶液和14％鹽酸羥胺溶液，混和即成。

(8)33.3％(V／V)鹽酸溶液：取比重為1.18的鹽酸50ml，加蒸餾水100ml。

(9)10％三氯化鐵溶液：稱(chēng)取FeCl��3·6H��2O 10g，用0.1 mol／L 鹽酸溶解，使成100ml。

四、實(shí)驗(yàn)方法

按表4-2進(jìn)行操作，每加一種試劑后均須充分搖勻，保溫時(shí)間須嚴(yán)格控制。

表4-2  比色測(cè)定法的實(shí)驗(yàn)操作步驟

用濾紙過(guò)濾，于15min內(nèi)用分光光度計(jì)比色，在525nm處比色，以空白管校正光密度到0點(diǎn)，讀取各管吸光度計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)管吸光度—測(cè)定管吸光度=全血ChE活力單位數(shù)

標(biāo)準(zhǔn)管吸光度

注：以1m1血液在規(guī)定條件下能分解lμmo1乙酰膽堿為1個(gè)膽堿酯酶活力單位。

(黃紅林 謝志忠)