�。ǘ�)四種脫氧三磷酸核苷酸（4×dNTPs)
在PCR反體系中dNTP終濃度高于50mmol/L會抑制Taq酶的活性，使用低濃度dNTP可以減少在非靶位置啟動和延伸時核苷酸錯誤摻入，高濃度dNTPs易產生錯誤摻入，而濃度太低，勢必降低反應物的產量。PCR常用的濃度為50～200μmol/L，不能低于10～15μmol/L。四種dNTP的濃度應相同，其中任何一種濃度偏高或偏低，都會誘導聚合酶的錯誤摻入，降低合成速度，過早終止反應。
決定最低dNTP濃度的因素是靶序列DNA的長度和組成，例如，在100μl反應體系中，4×dNTPs濃度若用20μmol/L，基本滿足合成2.6μg DNA或10pmol的400bp序列。50μmol/L的4×dNTPs可以合成6.6μg DNA,而200μmol/L足以合成25μg/DNA。
購自廠商的dNTP溶液一般均未調pH，應用1mol/l NaOH將dNTP貯存液pH調至7.0，以保證反應的pH值不低于7.1。市購的游離核苷酸凍干粉，溶解后要用NaOH中和，再用紫外分光光度計定量。醫(yī)學.全在線www.med126.com
�。ㄈ�)引物的量
引物在PCR反應中的濃度一般在0.1～1μmol/L之間。濃度過高易形成引物二聚體且產生非特異性產物。一般來說用低濃度引物經(jīng)濟、特異，但濃度過低，不足以完成30個循環(huán)的擴增反應，則會降低PCR的產率。
�。ㄋ�)Taq DNA聚合酶的量
典型PCR反應混合物中，所用酶濃度為2.5U/μl，常用范圍為1～4U/100μl。由于DNA模板的不同和引物不同，以及其它條件的差異，多聚酶的用量亦有差異，酶量過多會導致非特異產物的增加。
由于生產廠家所用兵配方、制造條件以及活性定義不同，不同廠商供應的Taq DNA聚合酶性能也有所不同。
Cetus公司酶定義是：1個酶單位是指在以下分析條件下，于74℃，30min內使10nmmol的dNTP摻入酸不溶性成分所需的酶。測定時間為10min，折算成30min摻入量。
分析條件為25nmol/L TAPS（三羥基-甲基-氨基丙烷磺酸鈉pH9.3,25℃),50mmol/l KCl, 2mmol/L MgCl2,1mmol/L β-ME（巰基乙醇)，dATP、dTTP、dGTP各200mmol/L，dCTP為100mmol/L(由不標記及α-32P標記混合)，12.μg變性鯡魚精子DNA，最終體積50μl。
�。ㄎ�)模板
單、雙鏈DNA或RNA都可以作為PCR的樣品。若起始材料是RNA，須先通過逆轉錄得到第一條cDNA。雖然PCR可以僅用極微量的樣品，甚至是來自單一細胞的DNA，但為了保證反應的特異性，還應用ng級的克隆DNA，μg水平的單拷貝染色體DNA或104拷貝的待擴增片段作為起始材料，模板可以是粗品，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制劑以及能結合DNA的蛋白。
DNA的大小并不是關鍵的因素，但當使用極高分子量的DNA（如基因組的DNA時)，如用超聲處理或用切點罕見的限制酶（如Sal1和Not1)先行消化，則擴增效果更好。閉環(huán)靶序列DNA的擴增效率略低于線狀DNA，因此，用質粒作反應模板時最好先將其線狀化。
模板靶序列的濃度因情況而異，往往非實驗人員所控制，實驗可按已知靶序列量逆減的方式（1ng,0.1ng,0.001ng等)，設置一組對照反應，以檢測擴增反應的靈敏度是否符合要求。
�。�)石蠟油
PCR擴增時建議在混合物上面鋪一層石蠟油，減少PCR過程中尤其是變性時液體蒸發(fā)所造成的產物的丟失。研究表明，應用石蠟油可使擴增產量增加5倍，可能與石蠟油維持熱恒定和整個反應體系中鹽濃度有關。
