二、噬菌體和病毒載體
噬菌體λ是最主要的一種載體。自從1974年以來，已用野生型λ改造和構(gòu)建出一系列噬菌體載體。
噬菌體λ是溫和噬菌體�；蚪M是長約50kb的雙鏈DNA分子。在噬菌體λ顆粒中，DNA是線狀雙鏈分子帶有單鏈的互補末端。末端長12個核苷酸，這稱為粘性末端，簡寫COS。當噬菌體感染宿主細胞后，雙鏈DNA分子通過COS而成環(huán)狀。在感染早期，環(huán)狀DNA分子進行轉(zhuǎn)錄。在此期間，噬菌體有兩條復制途徑可供選擇：一是裂解生長。環(huán)狀DNA分子在宿主細胞里復制若干次，合成了大量的噬菌體基因產(chǎn)物，形成子代噬菌體顆粒，成熟后使細菌裂解，釋放出許多新的有感染能力的病毒顆粒。另一是溶源性生長。噬菌體DNA整合進宿主菌的基因組，然后象細菌染色體上的基因一樣進行復制，并傳遞給下一代細菌。
�。ㄒ�)噬菌體λ載體的構(gòu)建
野生型噬菌體λDNA全長約50kb，上有65種限制酶酶切點，除ApaⅠ、NaeⅠ、NarⅠ、NheⅠ、Sna BⅠ、XbaⅠ和XhoⅠ等7種限制酶各有一個切點外，其余都多于2個。有些酶切點在λ增殖所必需的基因區(qū)域內(nèi)。因此，噬菌體λ必須經(jīng)過改造才能用作載體�，F(xiàn)在用的λ載體大都除去了某種限制酶的酶切點。因此，作為載體的噬菌體λ都短于野生型。
噬菌體λ載體有兩種類型：①插入型。由于改建后的噬菌體λDNA都短于野生型，所以可插入外源DNA。只要插入的位置不影響噬菌體增殖。而且噬菌體DNA缺失越長，插入片段就可越大。②置換型。噬菌體λ的基因組可分為三個區(qū)域，左側(cè)區(qū)包括使噬菌體DNA成為一個成熟的、有外殼的病毒顆粒所需的全部基因，全長約20kb。右側(cè)區(qū)內(nèi)包含所有的調(diào)控因子、與DNA復制及裂解宿主菌有關(guān)的基因，這個區(qū)域約長12kb。中間區(qū)域約長18kb，這一段DNA可以被外源置換而不會影響噬菌體λ裂解生長的能力。置換型噬菌體λ是使用最廣泛的載體。醫(yī)學全在線www.med126.com
噬菌體λ裂解生長的能力同包裝在頭蛋白中的λDNA的大小有關(guān)。當DNA的長度短于野生型的78%或超過105%時，噬菌體的活性就急劇下降。因此要求λ載體DNA和外源DNA長度之和在39～53kb之間。
置換型載體DNA用選定的限制酶完全酶切后，要設(shè)法除去中間片段，只留下左臂和右臂以便用外源DNA片段連接，包裝成重組噬噬體。這是因為左臂和右臂與中間片段間都有單鏈“粘性末端”，在連接酶作用下可以重新恢復原來的結(jié)構(gòu)，從而影響了同外源DNA的連接。區(qū)分重組噬菌體形成的噬菌斑和重新恢復的載體噬菌體形成的噬菌斑的方法是用Xgal藍色噬菌斑試驗。有些噬菌體載體的中間片段帶有編碼β半乳糖苷酸的基因。當這種噬菌體感染lac宿主細胞并在含有Xgal（5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷)的培養(yǎng)基上生長時，半乳糖苷酸與Xgal反應的產(chǎn)物為不溶性的靛藍染料。因此，含有中間片段的重新恢復的噬菌體形成藍色噬菌斑；而同外源DNA連接的重組噬菌體形成的噬菌斑是無色透明的。
�。ǘ�)單鏈噬菌體載體
最常用的單鏈噬菌體載體是M13和它的改建噬菌體。M13是絲狀噬菌體，有長約6500個核苷酸的閉環(huán)DNA基因組。M13附著在大腸桿菌的F性菌毛上，所以它們只能感染雄性細菌，即F’或Hfr細菌。當噬菌體進入細菌細胞后，單鏈的噬菌體DNA轉(zhuǎn)變成雙鏈復制型（RF)。從細胞中分離的RF可用作克隆雙鏈DNA的載體。當每個細菌細胞里積聚了200到300份RF型拷貝時，M13開始不對稱的合成，即只大量合成DNA雙鏈中的一條鏈。單鏈DNA摻入成熟的噬菌體顆粒，顆粒不斷地從感染細胞上芽生。M13感染雖不殺死細胞，但細胞的生長受到一定的抑制，所以形成混濁的噬菌斑。
M13的基因組中除有一段507個核苷酸，其余都含有與其復制有關(guān)的遺傳信息。因此，只有在這一段中可插入外源DNA而不致影響噬菌體的活性。用M13作為分子克隆載體的優(yōu)點是從細菌中釋放出來的噬菌體顆粒只含單鏈DNA，其中包含了克隆DNA片段的二條互補鏈中的一條，因此可用來作為對DNA測序的模板。另外，可用來產(chǎn)生單鏈的DNA探針以選擇和分離互補的RNA。M13的RF型是雙鏈DNA，便于限制酶的識別和切割，克隆進雙鏈的外源DNA。從細菌培養(yǎng)液中大量抽取單鏈DNA。問題是插入M13的外源DNA超1000bp時就不穩(wěn)定，在噬菌體增殖時會出現(xiàn)缺失。一般說，插入300～400bp是相當穩(wěn)定的。
