DNA重組實驗中常用的技術(shù)

　�。ǘ�)大腸桿菌感受態(tài)的制備及重組DNA的轉(zhuǎn)化

　　1．感受態(tài)的制備

　�。�1)接種單菌落于2ml LB培養(yǎng)液中， 37℃過夜。

　　（2)取0.25ml過夜菌入25ml LB培養(yǎng)液中，37℃振搖4～6h至A₅₉₀=0.4～0.6。

　�。�3)倒入50ml管內(nèi)，水浴10min，以2500～3000rpm離心5min，棄上清。

　　（4)緩慢加入75mmol/L預(yù)冷CaCl₂5ml懸浮菌體，冰浴20min，同上離心棄上清。

　　（5)緩慢加入75mmol/L預(yù)冷CaCl₂1.0ml輕輕混勻后分裝在1.5ml Eppendorf管中，每管200μl，冰浴1～2h。

　　2．重組DNA的轉(zhuǎn)化

　�。�1)將3只Eppendorf管按下列轉(zhuǎn)化項目作好標(biāo)記，然后按下述進(jìn)行：

　�。�2)冰浴30min至1h。中間搖動3次，以防受體菌沉底。

　�。�3)42℃90s。

　�。�4)37℃水浴5min。

　�。�5)加入無相應(yīng)抗生素的Lb 200μl，混勻后，37℃水浴30～60min。

　�。�6)分別取3組反應(yīng)物各50μl在含相應(yīng)抗生素的固體LB培養(yǎng)基平皿上涂布，室溫下干燥，然后倒置于37℃溫箱中培養(yǎng)過夜。

　�。ㄈ�)轉(zhuǎn)化子DNA的快速鑒定－快速細(xì)胞破碎法

　　（1)挑取轉(zhuǎn)化平板上的單菌接種于含相應(yīng)抗生素的2ml LB中，37℃振蕩培養(yǎng)至A₅₉₀值為0.6～0.8。

　�。�2)取1ml菌液至1.5ml Eppendorf管中，9000rpm離心9min，去盡上清。

　　（3)加入70μl Cracking Gel緩沖液[1mol/L Tris –HCl(pH6.8)10ml,20%SDS 10ml, 250mmol/L EDTA 1.6ml,蔗糖27.2g, 1.2%溴酚藍(lán)1.67ml，加雙蒸水至200ml]，混勻后，37℃水浴30min以上。

　　（4)15000rpm離心15min。

　�。�5)吸取上清點(diǎn)樣電泳，觀察。

　�。ㄋ�)轉(zhuǎn)化子DNA的酶切鑒定

　　1．轉(zhuǎn)化子DNA的快速少量抽提

　　（1)同本節(jié)　二.（三).1.

　�。�2)菌液移至5ml Eppendorf 管中，9000rpm,離心9min，去上清。

　�。�3)加溶液Ⅰ100μl，溶液Ⅱ200μl，溶液Ⅲ150μl，混勻，冰浴10min。

　�。�4)15000rpm離心15min。

　�。�5)吸取上清，加入異丙醇1ml混勻，置室溫15～30min。

　�。�6)15000rpm離心15min，棄上清，加入75%乙醇洗滌2次。

　�。�7)離心棄上清，真空抽干，加入適量1×TE溶解DNA。

　�。�8)取少量DNA電泳，觀察濃度。

　　2．轉(zhuǎn)化子DNA的小量酶切鑒定　　同質(zhì)粒DNA的小量酶切鑒定，見本節(jié)　一（三)。

　�。ㄎ�)重組子DNA的進(jìn)一步鑒定

　　可用Southern印跡雜交法或斑點(diǎn)雜交法等進(jìn)一步鑒定，詳見本節(jié)　四。

　　[附]電泳洗脫法回收酶切DNA片段

　�。�1)用合適的酶切割DNA并電泳。

　�。�2)于紫外燈下從凝膠上切下所要的DNA帶，裝入含1×TBE緩沖液的透析代內(nèi)，用夾子封好袋口，并檢查有無漏孔。

　�。�3)將透析袋（縱長)與兩極間的邊線垂直放于電泳槽內(nèi)電泳，4～5V/cm電泳至DNA貼緊袋壁。

　�。�4)取出透析袋，擠出凝膠塊，吸出袋內(nèi)液體放入1.5ml的離心管內(nèi)，10000rpm離心5min。

　�。�5)吸出上清放入離心管內(nèi)，加入等體積的飽和酚和等體積的氯仿，振蕩混勻，10000rpm離心5min，吸出上清放入新的離心管內(nèi)。

　�。�6)加入1/10體積的3mol/L AaAc,2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，于-20℃放置4～5h。

　　（7)于4℃，10000rpm離心15min，棄上清。

　　（8)用75%的酒精洗滌2次，每次均于4℃，10000rpm離心5min，棄上清。

　�。�9)真空抽干，并用適量1×TE溶解沉淀。如此即得所需DNA片段。

　　三、地高辛配基隨機(jī)標(biāo)記DNA探針法

　　（一)概述

　　基因診斷是以核酸分子雜交技術(shù)為基礎(chǔ)，在核酸水平檢測人類遺傳性疾病的基因缺陷和一些傳染病病原體的方法。其基本過程是：制備DNA探針，標(biāo)記探針，檢測樣本。開展這項工作的關(guān)鍵是要得到高靈敏度、高特異性的探針。以往人們是用放射性同位素來標(biāo)記探針DNA。近年來，非同位素標(biāo)記方法發(fā)展很快，已有取代同位素標(biāo)記法的趨勢。地高辛配基隨機(jī)標(biāo)記DNA探針法，是較為成功的一種非同位素標(biāo)記方法。其原理是：用化學(xué)方法把類固醇類半抗原地高辛分子連接在dUTP上（Dig-dUTP)。用隨機(jī)引物及DNA多聚酶，以探針DNA為模板，合成互補(bǔ)DNA，化學(xué)修飾過的dUTP同時摻入到標(biāo)記的DNA探針中。雜交后用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛單抗與標(biāo)記探針DNA中的Dig-dUTP結(jié)合，加入顯色底物，在堿性磷酸酶作用下，轉(zhuǎn)變成深棕色或藍(lán)色的化合物。

　　1．標(biāo)記　本試劑盒采用隨機(jī)引物標(biāo)記方法，可標(biāo)記少至10ng，多至3μg的DNA。能在新合成的DNA鏈每20～25個核苷酸，摻入一個Dig-dUTP，反應(yīng)時間約為1h。

　　2．雜交　按標(biāo)準(zhǔn)雜交方法進(jìn)行。可以采用尼龍膜或硝酸纖維素膜。用過的雜交液可凍存于-20℃，重復(fù)使用。

　　3．免疫學(xué)檢測　封阻后，檢測反應(yīng)的第一步，抗體結(jié)合物與標(biāo)記DNA結(jié)合，出現(xiàn)雜交的半抗原-標(biāo)記DNA，顯色反應(yīng)起始是在堿性pH條件下加入無色的顯色劑X-磷酸鹽和NBT，在幾分鐘內(nèi)便開始出現(xiàn)藍(lán)色，顯色反應(yīng)的過程持續(xù)3d。典型的例子是在24h后終止顯色反應(yīng)。用二甲基甲酰胺洗掉尼龍膜上的顏色后，尼龍膜可重新用于雜交。

　　4．應(yīng)用　地高辛配基標(biāo)記DNA探針及檢測試劑盒，能檢測0.1pg的同源DNA，能檢測1μg哺乳動物DAN中的單拷貝基因，與放射性標(biāo)記系統(tǒng)比較，此試劑盒能快速得到實驗結(jié)果（從DNA的標(biāo)記和雜交至見到檢測結(jié)果24h內(nèi)能完成)，而且消除了放射性的不安全問題。這試劑的靈敏度與特異性使它適用于所有的雜交技術(shù)（包括DNA-印跡轉(zhuǎn)移，菌落雜交，噬菌斑雜交及原位雜交)以替代同位素標(biāo)記和放射自顯影術(shù)。

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