列表模式其實(shí)只是多參數(shù)數(shù)據(jù)文件的一種計(jì)算機(jī)存貯方式，三個(gè)以上的參數(shù)數(shù)據(jù)顯示是用多個(gè)直方圖、二維圖和假三維圖來完成的。可用List Mode中的特殊技術(shù)，開窗或用游標(biāo)調(diào)出相關(guān)部分再改變維數(shù)進(jìn)行顯示。例如，“一調(diào)二”就是在一維圖上調(diào)出二維圖來；“二調(diào)一”就是從二維圖中調(diào)出一維圖來。圖10-6給出了從二維圖等高圖中調(diào)出相應(yīng)窗口的直方圖的示意圖。
圖10-6 從二維圖設(shè)窗調(diào)出直方圖示意
上面簡要地介紹了幾種數(shù)據(jù)顯示形式，在實(shí)際應(yīng)用中，可根據(jù)需要選擇匹配，以便了解和獲得盡可能多的有用信息。
②數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)分析的方法總的可分為參數(shù)方法和非參數(shù)方法兩大類。當(dāng)被檢測的生物學(xué)系統(tǒng)能夠用某種數(shù)學(xué)模型技術(shù)時(shí)則多使用參數(shù)方法。數(shù)學(xué)模型可以是一個(gè)方程或方程組，方程的參數(shù)產(chǎn)生所需要的信息來自所測的數(shù)據(jù)。例如在測定老鼠精子的DNA含量時(shí)，可以獲取細(xì)胞頻數(shù)的尖銳波形分布。如果采用正態(tài)分布函數(shù)來描述這些數(shù)據(jù)，則參數(shù)即為面積、平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。方程的數(shù)據(jù)擬合則通常使用最小二乘法。而非參數(shù)分析法對(duì)測量得到的分布形狀不需要做任何假設(shè)，即采用無設(shè)定參數(shù)分析法。分析程序可以很簡單，只需要直觀觀測頻數(shù)分布；也可能很復(fù)雜，要對(duì)兩個(gè)或多個(gè)直方圖逐道地進(jìn)行比較。
逐點(diǎn)描圖（或用手工，或用描圖儀、計(jì)算機(jī)系統(tǒng))是大家常用的數(shù)據(jù)分析的重要手段。我們�？梢杂脕砹私鈹�(shù)據(jù)的特性、尋找那些不曾預(yù)料的特異征兆、選擇統(tǒng)計(jì)分析的模型、顯示最終結(jié)果等。事實(shí)上，不經(jīng)過先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行直觀觀察分析就決不應(yīng)該對(duì)這批數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)值分析。從這一點(diǎn)來看，非參數(shù)分析是參數(shù)分析的基礎(chǔ)。
逐道比較工作量較大，但用直觀法很容易發(fā)現(xiàn)明顯的差異，特別是對(duì)照組和測試組�？紤]到FCM的可靠性，要注意到對(duì)每組測量，都要有對(duì)照組，對(duì)照組可以是空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、或零時(shí)刻對(duì)照組等，具體設(shè)置應(yīng)根據(jù)整體實(shí)驗(yàn)要求而定。對(duì)照組和測試組的逐道比較往往可以減少許多不必要的誤差和錯(cuò)誤解釋。順便指出，進(jìn)行比較時(shí)對(duì)曲線的總細(xì)胞數(shù)進(jìn)行歸一化處理，甚至對(duì)兩條曲線逐道相減而得到“差結(jié)果曲線”往往是適宜的。
因?yàn)閿?shù)據(jù)分析往往和結(jié)果解釋關(guān)系十分密切，也就是說和生物學(xué)背景相關(guān)，因此具體的分析法和原理將在后面結(jié)合實(shí)例再介紹。
3．流式細(xì)胞計(jì)的技術(shù)參數(shù) 為了表征儀器性能，往往根據(jù)使用目的和要求而提出幾個(gè)技術(shù)參數(shù)或指標(biāo)來定量說明。對(duì)于流式細(xì)胞計(jì)常用的技術(shù)指標(biāo)有熒光分辨率、熒光靈敏度、適用樣品濃度、分選純度、可分析測量參數(shù)等。
�。�1)熒光分辨率：強(qiáng)度一定的熒光在測量時(shí)是在一定道址上的一個(gè)正態(tài)分布的峰，熒光分辨率是指兩相鄰的峰可分辨的最小間隔。通常用變異系數(shù)（C.V值)來表示。C.V的定義式為：
C.V=σ/μ
式中，σ為標(biāo)準(zhǔn)偏差，μ是平均值。
在實(shí)際應(yīng)用中，我們使用挖關(guān)系式σ=0.423FWHM；其中FWHM為峰在峰高一半處的峰寬值。目前儀器的熒光分辨率均優(yōu)于2.0%。
�。�2)熒光靈敏度：反映儀器所能探測的最小熒光光強(qiáng)的大小。一般用熒光微球上所標(biāo)可測出的FITC（fluorescein isothiocyanate 異硫氰基熒光素)的最少分子數(shù)來表示。目前儀器均可達(dá)到1000左右。
�。�3)分析速度/分選速度：儀器每秒種可分析/分選的數(shù)目。一般分析速度為5000～10000；分選速度掌握在1000以下。
（4)樣品濃度：主要給出儀器工作時(shí)樣品濃度的適用范圍。一般在105～107細(xì)胞/ml的數(shù)量級(jí)。
其它技術(shù)參數(shù)尚多，不再一一介紹。
4．流式細(xì)胞計(jì)的調(diào)試和使用 古語說：“工欲善其事，必先利其器”。要想很好地應(yīng)用流式細(xì)胞分析和分選技術(shù)，必需先對(duì)儀器進(jìn)行調(diào)試，使其處于良好的工作狀態(tài)，并能正確使用儀器。下面簡要介紹細(xì)胞計(jì)的調(diào)試項(xiàng)目及要點(diǎn)、使用的程序等等。
�。�1)調(diào)試和校準(zhǔn)：流式細(xì)胞計(jì)在使用前，甚至在使用過程中都要精心進(jìn)行調(diào)試，以保證工作的可靠性和最佳性。調(diào)試的項(xiàng)目主要是激光強(qiáng)度、液流速度和測量區(qū)的光路等。
激光強(qiáng)度：除調(diào)整反射鏡的角度以調(diào)整到所需波長的激光出光外，還要結(jié)合顯示屏上的光譜曲線使激光的強(qiáng)度輸出為最大。
液流速度：可通過操作臺(tái)數(shù)字顯示監(jiān)督，調(diào)節(jié) 氣體壓力大小以獲得穩(wěn)定的液流速度。
測量區(qū)光路調(diào)節(jié) ：這是調(diào)試工作的關(guān)鍵。需要保證在測量區(qū)的液流、激光束、90。散射測量光電系統(tǒng)垂直正交，而且交點(diǎn)較小。一般可在用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球等校準(zhǔn)中完成。
流式細(xì)胞術(shù)中所測得的量是相對(duì)值，因此需要在使用前或使用中對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)或標(biāo)定，這樣才能通過相對(duì)測量獲得絕對(duì)的意義。因而FCM中的校準(zhǔn)具有雙重功能：儀器的準(zhǔn)直調(diào)整和定量標(biāo)度。標(biāo)準(zhǔn)樣品應(yīng)該穩(wěn)定，有形成份形狀應(yīng)是大小比較一致球形，樣品分散性能良好，且經(jīng)濟(jì)、容易獲得。常用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球作為非生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)樣品，雞血紅細(xì)胞做為生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)樣品。微球用樹脂材料制作，或標(biāo)有熒光素，或不標(biāo)記熒光素。Flow Cytometry Stands公司可提供熒光強(qiáng)度藥盒，在免疫實(shí)驗(yàn)中可用來作為定量熒光標(biāo)準(zhǔn)來測定每個(gè)細(xì)胞所標(biāo)記的抗原位點(diǎn)數(shù)目。所用的雞血紅細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品制作過程昭下：取3.8%枸櫞酸或肝素抗凝的雞血（抗凝劑：雞血=1：4)，經(jīng)PBS清洗3次，再用5～10ml的1.0%戊二醛與清洗后的雞紅細(xì)胞混合，室溫下振蕩醛化24h，最后經(jīng)PBS再清洗，貯4℃冰箱中備用。需要指出的是因?yàn)槲唇?jīng)熒光染色，所測光信號(hào)為雞血紅蛋白的自發(fā)熒光。
�。�2)儀器的操作和使用：
�、俅蜷_電源，對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)熱；
②打開氣體閾，調(diào)節(jié) 壓力，獲得適宜的液流速度；開啟光源冷卻系統(tǒng)；
�、墼跇悠饭苤屑尤肴ルx子水，沖洗液流的噴嘴系統(tǒng)；
�、芾眯�(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣品，調(diào)整儀器，使在激光功率、光電倍增管電壓、放大器電路增益調(diào)定的基礎(chǔ)上，0。和90。散射的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，并要求變異系數(shù)為最�。�
�、葸x定流速、測量細(xì)胞數(shù)、測量參數(shù)等，在同樣的工作條件下測量樣品和對(duì)照樣品；同時(shí)選擇計(jì)算機(jī)屏上數(shù)據(jù)的顯示方式，從而能直觀掌握測量進(jìn)程；
�、迾悠窚y量完畢后，再用去離子水沖洗液流系統(tǒng)；
�、咭�?yàn)閷?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)已存入計(jì)算機(jī)硬盤（有的機(jī)器還備有光盤系統(tǒng)，存貯量更大)，因此可關(guān)閉氣體、測量裝置，而單獨(dú)使用計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；
�、鄬⑺杞Y(jié)果打印出來。
在操作和使用中一定要注意如下事項(xiàng)：
1)光電倍增管要求穩(wěn)定的工作條件，暴露的較強(qiáng)的光線下以后，需要較長時(shí)間的“暗適應(yīng)”以消除或降低部分暗電流本底才能工作；另外還要注意磁屏蔽；
2)光源不得在短時(shí)間內(nèi)（一般要1h左右)關(guān)上又打開；使用光源必須預(yù)熱并注意冷卻系統(tǒng)工作是否正常；
3)液流系統(tǒng)必需隨時(shí)保持液流暢通，避免氣泡栓塞，所使用的鞘流液使用前要經(jīng)過過濾、消毒；
4)注意根據(jù)測量對(duì)象的變換選用合適的濾片系統(tǒng)、放大器的類型等；
5)特別強(qiáng)度每次測量都需要對(duì)照組。
本節(jié) 著重介紹了流式細(xì)胞計(jì)的基本結(jié)構(gòu)和工作原理、技術(shù)指標(biāo)及使用操作中的基本問題。由于實(shí)際使用的儀器廠家、型號(hào)差別很大，不能一一介紹，可參照儀器使用說明書使用。至于流式細(xì)胞術(shù)在生物醫(yī)學(xué)工程和免疫組織化學(xué)應(yīng)用中的一些具體技術(shù)途徑則在下節(jié) 詳細(xì)介紹。
