列表模式其實只是多參數(shù)數(shù)據(jù)文件的一種計算機存貯方式，三個以上的參數(shù)數(shù)據(jù)顯示是用多個直方圖、二維圖和假三維圖來完成的�？捎肔ist Mode中的特殊技術(shù)，開窗或用游標調(diào)出相關(guān)部分再改變維數(shù)進行顯示。例如，“一調(diào)二”就是在一維圖上調(diào)出二維圖來；“二調(diào)一”就是從二維圖中調(diào)出一維圖來。圖10-6給出了從二維圖等高圖中調(diào)出相應(yīng)窗口的直方圖的示意圖。
圖10-6 從二維圖設(shè)窗調(diào)出直方圖示意
上面簡要地介紹了幾種數(shù)據(jù)顯示形式，在實際應(yīng)用中，可根據(jù)需要選擇匹配，以便了解和獲得盡可能多的有用信息。
�、跀�(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)分析的方法總的可分為參數(shù)方法和非參數(shù)方法兩大類。當被檢測的生物學(xué)系統(tǒng)能夠用某種數(shù)學(xué)模型技術(shù)時則多使用參數(shù)方法。數(shù)學(xué)模型可以是一個方程或方程組，方程的參數(shù)產(chǎn)生所需要的信息來自所測的數(shù)據(jù)。例如在測定老鼠精子的DNA含量時，可以獲取細胞頻數(shù)的尖銳波形分布。如果采用正態(tài)分布函數(shù)來描述這些數(shù)據(jù)，則參數(shù)即為面積、平均值和標準偏差。方程的數(shù)據(jù)擬合則通常使用最小二乘法。而非參數(shù)分析法對測量得到的分布形狀不需要做任何假設(shè)，即采用無設(shè)定參數(shù)分析法。分析程序可以很簡單，只需要直觀觀測頻數(shù)分布；也可能很復(fù)雜，要對兩個或多個直方圖逐道地進行比較。
逐點描圖（或用手工，或用描圖儀、計算機系統(tǒng))是大家常用的數(shù)據(jù)分析的重要手段。我們�？梢杂脕砹私鈹�(shù)據(jù)的特性、尋找那些不曾預(yù)料的特異征兆、選擇統(tǒng)計分析的模型、顯示最終結(jié)果等。事實上，不經(jīng)過先對數(shù)據(jù)進行直觀觀察分析就決不應(yīng)該對這批數(shù)據(jù)進行數(shù)值分析。從這一點來看，非參數(shù)分析是參數(shù)分析的基礎(chǔ)。
逐道比較工作量較大，但用直觀法很容易發(fā)現(xiàn)明顯的差異，特別是對照組和測試組。考慮到FCM的可靠性，要注意到對每組測量，都要有對照組，對照組可以是空白對照組、陰性對照組、或零時刻對照組等，具體設(shè)置應(yīng)根據(jù)整體實驗要求而定。對照組和測試組的逐道比較往往可以減少許多不必要的誤差和錯誤解釋。順便指出，進行比較時對曲線的總細胞數(shù)進行歸一化處理，甚至對兩條曲線逐道相減而得到“差結(jié)果曲線”往往是適宜的。
因為數(shù)據(jù)分析往往和結(jié)果解釋關(guān)系十分密切，也就是說和生物學(xué)背景相關(guān)，因此具體的分析法和原理將在后面結(jié)合實例再介紹。
3．流式細胞計的技術(shù)參數(shù) 為了表征儀器性能，往往根據(jù)使用目的和要求而提出幾個技術(shù)參數(shù)或指標來定量說明。對于流式細胞計常用的技術(shù)指標有熒光分辨率、熒光靈敏度、適用樣品濃度、分選純度、可分析測量參數(shù)等。
�。�1)熒光分辨率：強度一定的熒光在測量時是在一定道址上的一個正態(tài)分布的峰，熒光分辨率是指兩相鄰的峰可分辨的最小間隔。通常用變異系數(shù)（C.V值)來表示。C.V的定義式為：
C.V=σ/μ
式中，σ為標準偏差，μ是平均值。
在實際應(yīng)用中，我們使用挖關(guān)系式σ=0.423FWHM；其中FWHM為峰在峰高一半處的峰寬值。目前儀器的熒光分辨率均優(yōu)于2.0%。
�。�2)熒光靈敏度：反映儀器所能探測的最小熒光光強的大小。一般用熒光微球上所標可測出的FITC（fluorescein isothiocyanate 異硫氰基熒光素)的最少分子數(shù)來表示。目前儀器均可達到1000左右。
�。�3)分析速度/分選速度：儀器每秒種可分析/分選的數(shù)目。一般分析速度為5000～10000；分選速度掌握在1000以下。
�。�4)樣品濃度：主要給出儀器工作時樣品濃度的適用范圍。一般在105～107細胞/ml的數(shù)量級。
其它技術(shù)參數(shù)尚多，不再一一介紹。
4．流式細胞計的調(diào)試和使用 古語說：“工欲善其事，必先利其器”。要想很好地應(yīng)用流式細胞分析和分選技術(shù)，必需先對儀器進行調(diào)試，使其處于良好的工作狀態(tài)，并能正確使用儀器。下面簡要介紹細胞計的調(diào)試項目及要點、使用的程序等等。
�。�1)調(diào)試和校準：流式細胞計在使用前，甚至在使用過程中都要精心進行調(diào)試，以保證工作的可靠性和最佳性。調(diào)試的項目主要是激光強度、液流速度和測量區(qū)的光路等。
激光強度：除調(diào)整反射鏡的角度以調(diào)整到所需波長的激光出光外，還要結(jié)合顯示屏上的光譜曲線使激光的強度輸出為最大。
液流速度：可通過操作臺數(shù)字顯示監(jiān)督，調(diào)節(jié) 氣體壓力大小以獲得穩(wěn)定的液流速度。
測量區(qū)光路調(diào)節(jié)�。哼@是調(diào)試工作的關(guān)鍵。需要保證在測量區(qū)的液流、激光束、90。散射測量光電系統(tǒng)垂直正交，而且交點較小。一般可在用標準熒光微球等校準中完成。
流式細胞術(shù)中所測得的量是相對值，因此需要在使用前或使用中對系統(tǒng)進行校準或標定，這樣才能通過相對測量獲得絕對的意義。因而FCM中的校準具有雙重功能：儀器的準直調(diào)整和定量標度。標準樣品應(yīng)該穩(wěn)定，有形成份形狀應(yīng)是大小比較一致球形，樣品分散性能良好，且經(jīng)濟、容易獲得。常用標準熒光微球作為非生物學(xué)標準樣品，雞血紅細胞做為生物學(xué)標準樣品。微球用樹脂材料制作，或標有熒光素，或不標記熒光素。Flow Cytometry Stands公司可提供熒光強度藥盒，在免疫實驗中可用來作為定量熒光標準來測定每個細胞所標記的抗原位點數(shù)目。所用的雞血紅細胞標準樣品制作過程昭下：取3.8%枸櫞酸或肝素抗凝的雞血（抗凝劑：雞血=1：4)，經(jīng)PBS清洗3次，再用5～10ml的1.0%戊二醛與清洗后的雞紅細胞混合，室溫下振蕩醛化24h，最后經(jīng)PBS再清洗，貯4℃冰箱中備用。需要指出的是因為未經(jīng)熒光染色，所測光信號為雞血紅蛋白的自發(fā)熒光。
�。�2)儀器的操作和使用：
�、俅蜷_電源，對系統(tǒng)進行預(yù)熱；
�、诖蜷_氣體閾，調(diào)節(jié) 壓力，獲得適宜的液流速度；開啟光源冷卻系統(tǒng)；
�、墼跇悠饭苤屑尤肴ルx子水，沖洗液流的噴嘴系統(tǒng)；
�、芾眯蕵藴蕵悠罚{(diào)整儀器，使在激光功率、光電倍增管電壓、放大器電路增益調(diào)定的基礎(chǔ)上，0。和90。散射的熒光強度最強，并要求變異系數(shù)為最�。�
�、葸x定流速、測量細胞數(shù)、測量參數(shù)等，在同樣的工作條件下測量樣品和對照樣品；同時選擇計算機屏上數(shù)據(jù)的顯示方式，從而能直觀掌握測量進程；
�、迾悠窚y量完畢后，再用去離子水沖洗液流系統(tǒng)；
�、咭驗閷嶒灁�(shù)據(jù)已存入計算機硬盤（有的機器還備有光盤系統(tǒng)，存貯量更大)，因此可關(guān)閉氣體、測量裝置，而單獨使用計算機進行數(shù)據(jù)處理；
�、鄬⑺杞Y(jié)果打印出來。
在操作和使用中一定要注意如下事項：
1)光電倍增管要求穩(wěn)定的工作條件，暴露的較強的光線下以后，需要較長時間的“暗適應(yīng)”以消除或降低部分暗電流本底才能工作；另外還要注意磁屏蔽；
2)光源不得在短時間內(nèi)（一般要1h左右)關(guān)上又打開；使用光源必須預(yù)熱并注意冷卻系統(tǒng)工作是否正常；
3)液流系統(tǒng)必需隨時保持液流暢通，避免氣泡栓塞，所使用的鞘流液使用前要經(jīng)過過濾、消毒；
4)注意根據(jù)測量對象的變換選用合適的濾片系統(tǒng)、放大器的類型等；
5)特別強度每次測量都需要對照組。
本節(jié) 著重介紹了流式細胞計的基本結(jié)構(gòu)和工作原理、技術(shù)指標及使用操作中的基本問題。由于實際使用的儀器廠家、型號差別很大，不能一一介紹，可參照儀器使用說明書使用。至于流式細胞術(shù)在生物醫(yī)學(xué)工程和免疫組織化學(xué)應(yīng)用中的一些具體技術(shù)途徑則在下節(jié) 詳細介紹。
