最初的聚合酶鏈反應(yīng)是用DNA聚合酶I的Klenow片段或T4DNA聚合酶催化的。但是由于每輪反應(yīng)都需要三個(gè)溫度點(diǎn)，尤其是模板變性需在較高的溫度下進(jìn)行，所以最初的PCR需要在每輪反應(yīng)中加入DNA聚合酶。這個(gè)問題在發(fā)現(xiàn)了耐熱DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶)后才得以完滿的解決。Taq DNA聚合酶分離自水棲高溫菌，其最適反應(yīng)溫度為75-80攝氏度，且經(jīng)90攝氏度以上的加溫后仍可在溫度恢復(fù)后復(fù)性。所以這種酶特別適合于在不同溫度點(diǎn)進(jìn)行循環(huán)加溫與降溫而不喪失酶的活性。因此被廣泛應(yīng)用于各種PCR。
圖23-1 RCP的基本原理
下面以愛滋病的臨床檢測為例，簡要說明一下PCR在病毒感染的基因診斷中的應(yīng)用。
組織中總RNA的提取
↓
利用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA
↓
PCR反應(yīng)：
反應(yīng)液組織：反應(yīng)緩沖液
↓
↓模板（上述合成的cDNA)
↓
底物（dATP,dGTP,dCTP,dTTP)
引物（愛滋病病毒特異性引物)
TaqDNA聚合酶 50μl
循環(huán)：95℃，30sec（變性)
↓
55℃，1min（退火) 30循環(huán)
↓
72℃，1min（聚合)
檢測：電泳或核酸雜交
