目的序列與載體DNA正確連接的效率、重組導(dǎo)入細(xì)胞的效率都不是百分之百的，因而最后生長(zhǎng)繁殖出來的細(xì)胞并不同都帶有目的序列。一般一個(gè)載體只攜帶某一段外源DNA，一個(gè)細(xì)胞只接受一個(gè)重組DNA分子。最后培養(yǎng)出來的細(xì)胞群中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的序列的重組體（recombinant)。將目的重組體篩選出來就等于獲得了目的序列的克隆，所以篩選(dcreening)是基因克隆的重要步驟。在構(gòu)建載體，選擇宿主細(xì)胞、設(shè)計(jì)分子克隆方案時(shí)都必須仔細(xì)考慮篩選的問題。以下就常用技術(shù)的基本原理加以介紹。
一、根據(jù)重組載體的標(biāo)志作篩選
最常見的載體攜帶的標(biāo)志是抗藥性標(biāo)志，如抗氨芐青霉素（anpr)、抗四環(huán)素(terr)、抗卡那霉素(kanr)等。當(dāng)培養(yǎng)基中含有抗生素時(shí)，只有攜帶相應(yīng)抗藥性基因載體的細(xì)胞才能生存繁殖，這就把凡未能接受載體DNA的細(xì)胞全部篩除掉了。如果外源目的序列是插入在載體的抗藥性基因中間使這抗藥性基因失活，這個(gè)抗藥性標(biāo)志就會(huì)消失。例如質(zhì)粒pBR322含有anpr、和terr兩個(gè)抗藥基因，若將目的序列插入terr基因序列中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，讓細(xì)菌放在含氨芐青霉素或四環(huán)素培養(yǎng)基中，凡未接受質(zhì)粒DNA的細(xì)胞都不能生長(zhǎng)；凡在含氨芐青霉素和四環(huán)素中都能生長(zhǎng)的細(xì)菌是含有質(zhì)粒pBR322的，但其pBR322未插入目的序列，凡在氨芐青霉素中能生長(zhǎng)、而在四環(huán)素中不能生長(zhǎng)的細(xì)菌就很可能是含有目的序列的重組質(zhì)粒。
載體含有l(wèi)acZ’的藍(lán)白篩選法，近年更被廣泛應(yīng)用。例如將目的序列插入前面述及的質(zhì)粒pUC19的多克隆位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，放入含氨芐青霉素、IPTG、X-gal的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，凡能生長(zhǎng)并呈白色的菌落，其細(xì)菌中就很可能含有插入目的序列的重組質(zhì)粒，這樣就很容易獲得目的序列的克隆。
根據(jù)重組載體的標(biāo)志來篩選，可以篩選去大量的非目的重組體，但還只是粗篩，例如細(xì)菌可能發(fā)生變異而引起抗藥性的改變，卻并不代表目的序列的插入，所以需要做進(jìn)一步細(xì)致的篩選。
二、核酸雜交法
利用標(biāo)記的核酸做探針與轉(zhuǎn)化細(xì)胞的DNA進(jìn)行分子雜交，可以直接篩選和鑒定目的序列克隆。常用的方法是將轉(zhuǎn)化后生長(zhǎng)的菌落復(fù)印到硝酸纖維膜上，用堿裂菌，菌落釋放的DNA就吸附在膜上，再與標(biāo)記的核酸探針溫育雜交，核酸探針就結(jié)合在含有目的序列的菌落DNA上而不被洗脫。核酸探針可以用放射性核素標(biāo)記，結(jié)合了放射性核酸探針的菌落集團(tuán)可用放射性自顯影（auroradiography)法指示出來，核酸探針也可以用非放射性物質(zhì)標(biāo)記，通常是經(jīng)顏色呈現(xiàn)指示位置，這樣就可以將含有目的序列的菌落挑選出來。
三、PCR法
PCR技術(shù)的出現(xiàn)給克隆的篩選增加了一個(gè)新手段。如果已知目的序列的長(zhǎng)度和兩端的序列，則可以設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，以轉(zhuǎn)化細(xì)胞所得的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，若能得到預(yù)期長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物，則該轉(zhuǎn)化細(xì)胞就可能含有目的的序列。醫(yī)學(xué) 全在.線提供
四、免疫學(xué)方
利用特定抗體與目的基因表達(dá)產(chǎn)物特異性結(jié)合的作用進(jìn)行篩選。此法不是直接篩選目的基因，而是通過與基因表達(dá)產(chǎn)物的反應(yīng)指示含有目的基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，因而要求實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要使目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后能夠表達(dá)出其編碼產(chǎn)物�？贵w可用特定的酶常用過氧化物酶、堿性磷酸酶等標(biāo)記，結(jié)合酶標(biāo)抗體處，酶可催化特定的底物分解而呈現(xiàn)顏色，從而指示出含有目的的基因的細(xì)胞集落位置。免疫學(xué)方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，適用于從大量轉(zhuǎn)化細(xì)胞集合體中篩選很少幾個(gè)含目的基因的細(xì)胞克隆。
五、DNA限制性內(nèi)切酶圖譜分析
這是在上述篩選后的進(jìn)一步分析。目的序列插入載體會(huì)使載體DNA限制性酶圖譜（restriction map)發(fā)生變化，例如一個(gè)長(zhǎng)600bp的目的序列利用它兩端的EooR I和SalI切后的粘末端連接插入pUC19的多克隆點(diǎn)，則重組質(zhì)粒就增大為3.3kb，用Eoor I和SalI雙酶切后會(huì)出現(xiàn)600bp和-2.7kb兩個(gè)DNA片段，提取轉(zhuǎn)化細(xì)菌的質(zhì)粒DNA作酶切后做電泳觀察其酶切圖譜，就能分析得結(jié)果；如插入的目的序列中有其它限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，也能在酶切電泳圖譜上觀察到。這就可以進(jìn)一步鑒定重組體是不是所要的目的克隆。
六、核苷酸序列測(cè)定
所得到的目的序列或基因的克隆，都要用其核酸序列測(cè)定來最后鑒定。已知序列的核酸克隆要經(jīng)序列測(cè)定確證所獲得的克隆準(zhǔn)確無誤；未知序列的核酸克隆要測(cè)定序列才能確知其結(jié)構(gòu)、推測(cè)其功能，用進(jìn)一步的研究。因此核酸序列測(cè)定是分子克隆中必不可少的鑒定步驟。核酸序列測(cè)定的原理和方法在實(shí)驗(yàn)教材中有詳細(xì)的敘述。
