自1983年澳大利亞的Warran和Matshall從慢性活動(dòng)性胃炎病人胃粘膜活檢標(biāo)本中找到幽門螺桿菌（Helicobacter pylori,Hp)后，先后已有英國(guó)、荷蘭、德國(guó)、美國(guó)、加拿大、日本、秘魯及我國(guó)從慢性胃炎和消化性潰瘍等病人中分離到此菌。這此些報(bào)道普遍反映了胃粘膜中Hp檢出與慢性胃炎、消化性潰瘍的存在兩者之間有高度的相關(guān)性。Matshall(1985)和Morris(1987)先后還用Hp作自身感染實(shí)驗(yàn)，均證明能引起急慢性胃炎，Morris并觀察到能發(fā)展成慢性胃炎，這進(jìn)一步證實(shí)了Hp對(duì)人類胃粘膜致病的可能性。但Hp如何致��？Hp是否屬于彎曲菌屬？目前仍存在著爭(zhēng)議。為此，本文用透射和掃描電鏡對(duì)Hp形態(tài)結(jié)構(gòu)及其與胃粘膜上皮的關(guān)系進(jìn)行了觀察，旨在為闡明Hp的生物學(xué)地位及致病性提供某些線索。
1 材料和方法
1.1 活檢標(biāo)本及菌種
33例活檢標(biāo)本采自經(jīng)內(nèi)窺鏡診斷為淺表性或萎縮性胃炎患者近幽門部位的胃粘膜。Hp菌種31株，從慢性胃炎或消化性潰瘍患者胃粘膜活檢中分離而得�？漳c彎曲菌（Campylobacterjejuni,CJ)菌株：CJ（CF-1)由上海市衛(wèi)生防疫站提供：CJ（82-56)由蘇州醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室提供。胎兒彎曲菌（Campylobacter fetus,CF)及結(jié)腸彎曲菌（Campylobactercoli,CC)菌種各兩株，其中CF（GIFu 8735)及CC（GIFU 8733)由日本大阪大學(xué)三輪各俊夫教授提供，另有CF及CC各一株由法國(guó)巴黎第五大學(xué)Berche教授提供。
1.2 電鏡檢查
1.2.1 透射電鏡標(biāo)本制備活檢標(biāo)本在含2.0%戊二醛的二甲砷酸鈉緩沖液（pH7.3)中固定2h～4h，二甲砷酸鈉緩沖液洗2次后在1%四氧化鋨中作后固定、包埋、超薄切片。菌株超切片標(biāo)本取自血平板上培養(yǎng)2d～3d的菌落。無(wú)菌生理鹽水輕輕洗下，3000r/min20min離心沉淀，棄上清，以無(wú)菌生理鹽水重復(fù)洗滌一次后，取沉淀作透射電鏡標(biāo)本制備，方法同上。
細(xì)菌懸滴標(biāo)本制備：于清潔蠟塊上滴一滴新鮮培養(yǎng)的細(xì)菌懸液，以噴涂炭膜的銅網(wǎng)覆蓋其上，靜止15min，取下銅網(wǎng)，用濾紙吸去殘剩液體。再覆蓋在一滴20%的磷鎢酸上負(fù)染15min，取下銅網(wǎng)，吸去殘剩液體，自然干燥后待檢。上述各標(biāo)本在日立-500電鏡下觀察。
1.2.2 掃描電鏡標(biāo)本制備活檢標(biāo)本（用生理鹽水洗去表面雜菌及粘液)在戊二醛二甲砷酸鈉固定液中固定2h～3h，經(jīng)二甲砷酸鈉緩沖液洗2次后，直接在乙醇中作梯度脫水，然后移入100%醋酸異戊酯，在臨界點(diǎn)下干燥，真空涂金。菌落標(biāo)本制備：取經(jīng)2d～3d培養(yǎng)的Hp血平板，選擇菌落生長(zhǎng)良好區(qū)域，節(jié)下約1cm2瓊脂塊，輕輕浸入上述電鏡標(biāo)本固定注中固定。隨后制備步驟同上。上述標(biāo)本均在JEOlJSM-840掃描電鏡下觀察。
2 結(jié)果
2.1 Hp的形態(tài)結(jié)構(gòu)從不同病人胃粘膜上分離得Hp的形態(tài)結(jié)構(gòu)基本一致，呈“S”形彎曲、弧形或稍直，偶見(jiàn)分支狀。一般表面較光滑，末端或二端（多數(shù)為一端)具有2～6條鞭毛，長(zhǎng)度稍長(zhǎng)于菌體。鞭毛外均有明顯的鞘，帶鞘的鞭毛直徑約50nm的圓球狀結(jié)構(gòu)相連。菌體末端鞭毛基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)內(nèi)側(cè)，有一寬達(dá)200nm～400nm的電子密度明顯降低區(qū)域，其底部無(wú)明顯的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)為界。在光滑的菌體表面有進(jìn)呈現(xiàn)大小較均勻、排列整齊的突起。在參考菌株中，CJ與CC末端呈圓錐體樣，稍尖，頂端明顯地呈吸盤樣結(jié)構(gòu)。GF亦見(jiàn)較小的吸盤樣凹陷。CF，CC，CF均有單根無(wú)鞘端鞭毛從頂端的吸盤樣凹陷中伸出。根部均未見(jiàn)圓球體狀基礎(chǔ)，CJ與CC均未見(jiàn)電子密度明顯降低區(qū)域。
2.2 Hp與胃粘膜上皮的關(guān)系活檢標(biāo)本包括胃粘膜及其表面的粘液兩部分。一般情況下，zxtf.net.cn/kuaiji/胃粘膜上皮與粘液層間不存在細(xì)菌。若出現(xiàn)細(xì)菌，常為大小、形態(tài)都呈彎曲樣特征的菌群。多聚居在胃小凹的細(xì)胞與細(xì)胞間連接處部位。偶然尚可見(jiàn)Hp存在于壁細(xì)胞的分泌小管中。Hp與粘膜上皮細(xì)胞間保持一定的間距，借眾多的細(xì)絲狀網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使兩者互相粘附。另一種是細(xì)菌的部分細(xì)胞壁與上皮細(xì)胞的細(xì)膜膜直接相貼粘附，二者間幾無(wú)間距。以前者較為多見(jiàn)，有時(shí)在同一細(xì)菌可出現(xiàn)兩種粘附現(xiàn)象。在粘膜上皮表面有Hp粘附的區(qū)域附近，往往有炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)和滲出。Hp粘附處的上皮細(xì)胞除微絨毛明顯減少或消失外，很少發(fā)現(xiàn)有明顯的細(xì)胞病理學(xué)變化。胃粘膜上皮細(xì)胞中偶見(jiàn)對(duì)Hp吞噬現(xiàn)象。粘膜上廠表面的粘液層分不溶性粘液與可溶性粘液兩部分。正常情況下不溶性粘液層為包裹在粘膜上皮表面的連續(xù)層，可溶性粘液為其周圍的流動(dòng)滋潤(rùn)層。在超薄切片下，出現(xiàn)Hp的標(biāo)本中，Hp在不溶性粘液層中大致呈散在的分布狀態(tài)，且大多呈同方向排列。不溶性粘液中的Hp主要呈橫斷面，而在其外側(cè)的可溶性粘液層中則隨意排列，還可見(jiàn)到縱斷面、橫斷面甚至斜斷面等不同的切面。經(jīng)用無(wú)菌生理鹽水充分沖洗的活檢標(biāo)本，在掃描電鏡下可見(jiàn)Hp不規(guī)則地粘附在不溶性粘液層表面。
3 討論
目前彎曲菌屬的分類，主要根據(jù)光鏡下的形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生化反應(yīng)及其DNA的G加C百分比含量等。這些性質(zhì)與螺菌族中其他細(xì)菌有很多交叉，以致造成對(duì)Hp歸屬的意見(jiàn)不一。我們用透射電鏡和掃描電鏡進(jìn)行了形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察，并參考有關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)Hp與CJ，CC，CF在鞭毛源出部位，數(shù)量及結(jié)構(gòu)等方面存在著明顯的不同。例如，Hp與CJ，CC，CF均有端鞭毛。我們從Hp中看到每一根鞭毛有一只鑲嵌在細(xì)胞膜和細(xì)胞壁中的，圓球體為基礎(chǔ)，其內(nèi)側(cè)尚有一明顯的電子密度降低區(qū)。而其他彎曲菌屬細(xì)菌卻未找到此結(jié)構(gòu)，僅CF亦見(jiàn)有電子密度降低區(qū)。由此可見(jiàn)Hp鞭毛及共結(jié)構(gòu)的特征與彎曲菌屬其他細(xì)菌有所不同。而Hp的末端鈍圓等與水螺菌中的一個(gè)種（Aquaspirillum serpens,AS)卻相似，因此有人認(rèn)為它很可能屬水螺菌屬。Hp與彎曲菌屬其他細(xì)菌間的區(qū)別除了鞭毛及其有關(guān)結(jié)構(gòu)外，Hp能分解尿素，而其他主要的彎曲菌屬細(xì)菌均不分解尿素，亦是一重要特征。另外還在分類學(xué)上有重要意義的菌體脂肪酸組成、16rRNAHp的部分核苷酸順序分析、菌體蛋白質(zhì)電泳圖譜方面Hp與彎曲菌屬的主要代表菌種之間都有明顯差別。因此Hp是否應(yīng)屬?gòu)澢�，還值得商榷。
Hp致病機(jī)理，雖然有 Marshall和Morrzxtf.net.cn/hushi/is等作了自身感染實(shí)驗(yàn)，但它的具體致病機(jī)理仍然缺少解釋。從我們?cè)陔婄R下觀察，Hp進(jìn)入機(jī)體后侵入的途徑很可能是：Hp首先粘附在不溶性粘液層表面，然后藉其螺旋狀菌體特征及特殊的鞭毛運(yùn)動(dòng)方式迅速鉆入不溶性粘液層中間，繼而與粘膜上皮細(xì)胞接觸，并大多在胃小凹及粘膜上皮細(xì)胞連接處粘附定居。胃中寄生菌雖然不多，但過(guò)路菌是很雜的，且胃酸比較強(qiáng)，粘膜表面有不溶性粘液層作屏障，胃粘膜上皮及其分泌的粘液代謝又很快，為什么僅有Hp能在胃粘膜上寄生？這一方面可能由于Hp螺旋狀的菌體特征和它鞭毛的特殊運(yùn)動(dòng)方式，促使它比一般腸道桿菌更容易穿透不溶性粘液層。由于不溶性粘液的分子結(jié)構(gòu)呈索條狀，當(dāng)Hp鉆入其間時(shí)，易呈相對(duì)平行狀態(tài)，這與光鏡下所見(jiàn)Hp在粘液中呈魚(yú)貫狀分布相符。另一方面可能由于Hp對(duì)粘膜上皮細(xì)胞有特殊的親和結(jié)構(gòu)。正如我們所觀察到的那兩種粘附現(xiàn)象，它們很可能在這中間起著重要的決定作用。這種特異性粘附現(xiàn)象從胃的腸化生組織找不到Hp，在腸的胃脂有利于組織卻能找到，從而間接得到了證明。這種有高度特異的親和機(jī)制促使Hp能克服胃粘膜上皮的不斷代謝更新過(guò)程，而繼續(xù)在新生的粘膜上皮上定居寄生。然后可能再通過(guò)其生產(chǎn)的細(xì)胞毒素及尿素酶直接和間接作用，造成胃粘膜上皮的局部病損。
Hp表面出現(xiàn)有規(guī)則的突起、在CF、AS中已有報(bào)道，Kist認(rèn)為是菌體外膜蛋白層的組成部分，而Winter認(rèn)為是微莢膜。光鏡下所見(jiàn)Hp的微莢膜樣結(jié)構(gòu)可能就屬之。McCoy認(rèn)為這類結(jié)構(gòu)具有抗吞噬作用。但我們將Hp加入新鮮抗凝人血作吞噬實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Hp很容易被吞噬。這亦可使胃上皮細(xì)胞對(duì)其有吞噬作用得到解釋。從目前觀察到的慢性胃炎病人胃粘膜活檢中出現(xiàn)的一些主要特異性組織病理學(xué)表現(xiàn)，例如炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)和滲出等，很可能是因Hp在胃粘膜上皮細(xì)胞上粘附或被上皮細(xì)胞及炎性細(xì)胞吞噬后釋放的趨化因子所引起，至于Hp是否有其他致病因子，尚待進(jìn)一步研究。
