中國幽門螺桿菌研究:幽門螺桿菌長期保存后染色體DNA酶切圖譜的分析

幽門螺桿菌是近年來從人體胃組織中發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)菌，與胃和胃潰瘍的發(fā)生有密切關(guān)系，而空腸彎曲菌則是近十年來國內(nèi)外學(xué)者較為注意的腹瀉致病菌，這兩種細(xì)菌營養(yǎng)要求及培養(yǎng)條件均較高，特別在菌株保存方面，至今還存在不少問題，為了更好地開展這些疾病的基礎(chǔ)研究，我們對不同種類的彎曲菌，在20%小牛血清布氏肉湯和全羊血中保存，于不同時間檢查了存活情況、生物學(xué)特性及染色體DNA的酶切圖譜，實(shí)驗(yàn)證明，用這種方法保存，在存活率、菌體形態(tài)、生物特性保持較好，染色體DNA酶切帶型前后保持一致。

1 材料和方法

1.1 菌株 幽門螺桿菌自各型胃病患者的胃粘膜中分離，共15株。空腸彎曲菌由國內(nèi)不同地區(qū)分離，共34株（其中人源菌11株，雞源菌8株，鴨源菌6株，鵝源菌4株、豬源菌2株、羊源菌3株)，另外從比利時引進(jìn)空腸彎曲菌3株（Cj22，32，26)，結(jié)腸彎曲菌2株（Cc25，29)及海鷗彎曲菌3株（Cl34，35，36)和分子量測定用經(jīng)過HindⅢ酶解的標(biāo)準(zhǔn)γ噬菌體DNA。

1.2培養(yǎng)基 試驗(yàn)用培養(yǎng)基用改良布氏瓊脂及布氏肉湯均按參考文獻(xiàn)配制。

1.3zxtf.net.cn/job/ 染色體DNA提取 彎曲菌經(jīng)37°C48h在混合氣體（10%CO2，5%O2，85%N2)條件下培養(yǎng)，每個平皿20mlT.E洗菌，置30ml的離心管，經(jīng)5000rpm/分離心10min，棄上清，沉淀用10mlT.E懸浮，加10%SDS1.5ml于65°C水浴中1h；用酚抽提3次，酚/氯仿異戊醇抽提5次以上，再用氯仿抽提2次；然后透析)T.Hp8.0)24h以上，換T.E4次，用玻棒纏繞經(jīng)異丙醇沉淀的DNA，再用75%乙醇浸泡2次，每次10min，將坡棒倒插，DNA向上，室溫中涼干；用800μlT.E將玻棒上的DNA洗入小離心管中，于-20°C中保存。

1.4 彎曲菌染色體DNA酶切 用PstⅠ,HindⅢ E.coRI,Bg1Ⅱ,XbaⅠ五種酶進(jìn)行試驗(yàn)，各種酶均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。

2 結(jié)果

2.1 過氧化氫酶陽性彎曲菌的生物學(xué)特性

對于-70°C條件下保存不同時間的彎曲菌主要生物學(xué)生物學(xué)特性：生長溫度，1%甘氨酸的生長，對萘啶酮酸敏感性，尿素酶活必以及馬尿酸水解，進(jìn)行了檢查與比較，基本特性與初分離時相同，其結(jié)果見表1。

表1 過氧化氫酶陽性彎曲菌經(jīng)-70°C保存后生物學(xué)特性

以上結(jié)果表明在-70C條件下保存，彎曲菌復(fù)蘇快，性狀穩(wěn)定。

2.2 彎曲菌于低溫（-70°C)條件下存活檢查

各種彎曲菌在布氏血瓊脂中，經(jīng)10代以目上傳代穩(wěn)定后，一般在混合氣體條件下，于37°C經(jīng)24h～48h培養(yǎng)后，均能見到較為豐富的生長，經(jīng)涂片作0.3%復(fù)紅單染色，鏡檢一般均能見到生長典型的彎曲菌，然后用Eppendorff離心管加1ml20%小牛血清布氏肉湯（或全羊血)，將培養(yǎng)物用白金耳直接刮到小管內(nèi)，形成濃厚的菌液，以后將小管在-20°C中預(yù)凍，次日再保存在-70°C中，經(jīng)不同時間檢查存活情況，結(jié)果如表2。可見在3～10個月內(nèi)于-70°C條件下，全部存活，以上保存方法簡便，易行，可作為彎曲菌保存。

表2 各種彎曲菌經(jīng)-70°C低溫保存后檢查

2.3 經(jīng)傳代冷凍保存后，彎曲菌染色體DNA酶切圖譜檢測

2.3.1 空腸彎曲菌染色體DNA酶切 實(shí)驗(yàn)分兩步進(jìn)行 ①取空腸彎曲菌E3、E4（鵝源菌)，G891（雞源菌)，流羊27（羊源菌)的染色體DNA，分別用三種內(nèi)切酶進(jìn)行消解（HindⅢ、PstⅠXbaⅠ)各管于37°C水浴中，作用1.5h，然后進(jìn)行電泳，電泳在穩(wěn)壓下進(jìn)行，電壓為50V，電泳完畢后將瓊脂糖凝膠（E.B加在凝膠中)置紫外燈下觀察，并照像。②經(jīng)初步試驗(yàn)后，又取適宜的PstⅠ進(jìn)行消解，獲得前后對比較好的結(jié)果。

2.3.2 幽門螺桿菌染色體DNA酶切 幽門螺桿菌自三種不同胃病患者的胃粘膜中分離，Cp397（慢性胃炎、潰瘍病)，Cp400（十二脂腸球潰瘍)，Cp407（淺表萎縮性胃炎)，提取染色體DNA后，用Bg1Ⅱ進(jìn)行酶解，各管于37°C水浴中，作用2.5h電泳40V.2h后30V17h，電泳后將瓊脂糖凝膠（E.B加在凝膠中)置紫外燈下觀察照像。可以看出用HindⅢPstⅠey XbaⅠ對不同彎曲菌酶切圖譜有所不同，但其中以PstⅠ酶切的帶型較清晰，還可看到四株不同來源的空腸彎曲菌及三株幽門螺桿菌，在較為長期保存后，染色體DNA酶切圖譜帶型完全一致。

3 討論

彎曲菌菌種保存，對于深入開展對本菌的研究，有著非常重要的意義，文獻(xiàn)上介紹的方法不多，幽門螺桿菌用全血或加20%小牛血清布氏湯或加入各種添加劑進(jìn)行保存，但時間均不太長，Drum等用10%小牛血清布氏湯液體培養(yǎng)物，經(jīng)24h培養(yǎng)后，添加50%甘油及小牛血清，于-70°C中能存活6個月；空腸彎曲菌用50%卵黃鹽水，使用時，接種一白金耳菌苔，置微氧罐內(nèi)，增殖24h，換上橡皮塞，置35°C溫箱中，可保存5個月之久，在布氏肉湯內(nèi)于-20°C中可存活2個月；15%甘油布氏肉湯中，在-70°C中可存活半年，但以上方法所保存的菌株，均不能獲得完全存活；而我們所用的10%的小牛血清布氏肉湯，將24h～48h的新鮮菌苔，直接刮到保存的Eppendorff離心小管中，每管加培養(yǎng)基1ml，不需重新培養(yǎng)，可直接置-20°C中預(yù)凍，過夜后，再于-70°C中作長期保存，細(xì)菌染色體DNA限制性內(nèi)切酶分析，可應(yīng)用于流行病學(xué)調(diào)查及菌型的鑒定，同型的菌株應(yīng)該有完全相同的染色體DNA酶譜；實(shí)驗(yàn)證明經(jīng)這種方法對彎曲菌保存后、其生物學(xué)特性及染色體DNA酶切圖譜的檢查，均獲得性狀的前后一致，因此，這是一種比較簡易可行的保藏方法，但對更為長期的保存，仍需作進(jìn)一步的研究