細胞和分子免疫學(xué):第四節(jié)　免疫細胞中的凋謝

生存和死亡是存在于所有生物的一對矛盾，它們維持著生物界的平衡，機體的免疫系統(tǒng)亦不例外，免疫細胞的增殖和死亡是免疫系統(tǒng)得以保持自身平衡的重要條件。

細胞的死亡是人們很早就注意到的現(xiàn)象。1972年Kerr首先提出了有別于一般死亡意義的一種新的概念，稱之為凋謝（apoptosis)。對凋謝的研究近年來進展很快，引起了多學(xué)科的廣泛重視，為腫瘤和自身免疫性疾病的防治等研究方面提供了新的思路。

一、凋謝的生物學(xué)特征

（一)凋謝的概念

細胞的死亡有兩種方式，第一種是細胞在受到嚴重的操作后發(fā)和的死亡，通常表現(xiàn)為細胞的突然死亡。在死亡過程的最早期，線粒體的功能和形態(tài)即發(fā)生變?nèi)私?jīng)，繼之，細胞失去自身平衡，細胞膜的操作導(dǎo)致滲透壓平衡的失調(diào)，細胞出現(xiàn)腫脹，最后胞膜破裂，胞漿內(nèi)容物外泄，引起組織器官的炎癥反應(yīng)，這種方式被稱為壞死（necrosis)。

另一種細胞死亡的方式是1972年Kerr等在正常的生理狀態(tài)下觀察到的，這處死亡方式最初被描述為一種正常生理狀態(tài)下的形態(tài)學(xué)改變。8年以后，這個實驗小組將這種形式的細胞死亡命名為凋謝，以區(qū)別于壞死。凋謝是機體的正常細胞在受到生理性和病理性刺激后啟動的自發(fā)的死亡過程，是一種主動的、信號依賴的過程，包括胞漿內(nèi)Ca²⁺、cAMP升高，RNA和蛋白質(zhì)合成增加。其典型的特征是一種內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活和由此導(dǎo)致的細胞染色體DNA的降解，DNA在核小體外被切斷，形成約185bp或整數(shù)倍長度的DNA片段，DNA電泳時形成特征性的梯形（ladder)電流條帶。這種細胞死亡方式的另一個特點是，降解的胞漿及胞核成份被包裹于膜性成分中而形成凋謝小體（apoptosis bodies)，胞膜成份和結(jié)構(gòu)的改變可以被吞噬細胞表面的粘附分子及磷脂酰絲氨酸受體（phosphatidylserine receptor)快速識別，凋謝細胞被吞噬并降解，因此不引起局部的炎癥反應(yīng)。

（二)凋謝與壞死、程序化細胞死亡

壞死是由于補體或裂解性病毒等致細胞裂解因素造成的細胞胞膜的直接損傷，或是由于其它因素干擾胞膜上的能量依賴泵的功能而造成細胞水分、離子濃度的失衡，導(dǎo)致細胞膜破裂，胞漿內(nèi)容物外泄，進而引起炎癥，是一種病理狀態(tài)下的細胞死亡。

在描述細胞死亡的術(shù)語中，還有一個概念是程序化細胞死亡（programmed cell death,PCD)。PCD最初是發(fā)育學(xué)的一個術(shù)語，是指機體發(fā)育過程中出現(xiàn)的一系列與發(fā)育相關(guān)的細胞生理性死亡過程。后來，這個概念被用來指由基因介導(dǎo)的細胞死亡，例如放射性照射的未成熟T細胞經(jīng)歷的死亡過程。啟動PCD的因素通常為正常的生理信號，其發(fā)生需要有某些基因的表達，給將發(fā)生PCD的細胞加入RNA或蛋白質(zhì)合成抑制劑，不但不會促進PCD的發(fā)生，反而延遲或阻止PCD的發(fā)生。

凋謝和程序化細胞死亡并不是完全相同的，大部份的PCD過程伴有凋謝的形態(tài)學(xué)改變。但某些物種組織細胞在發(fā)育過程中經(jīng)歷的PCD并沒有凋謝典型的胞膜出泡、染色質(zhì)局限化和DNA降解。本文中，我們把凋謝和程序化細胞死亡當成是一種通用的概念。

（三)與凋謝相關(guān)的基因

所有的PCD過程都有新基因的表達和蛋白質(zhì)的合成，在絕大多數(shù)凋謝也是如此。PCD所需的蛋白在正常的細胞中是非組成性表達的，即這些基因的表達是誘導(dǎo)性的。已報道有大量的基因可能與PCD的發(fā)生有關(guān)，它們促進或抑制PCD的發(fā)生，如c-fos、c-myc、TGF-β、p53、bcl-2、apt-4、apt-5、nuc-1、ces-2、ced-3、egl-1等。到目前為止，這些基因中只有小部分被確定為PCD所必需，如p53和cel-1等。到目前為止，這些基因中只有小部分被確定為PCD所必需，如p53和c-myc的表達可以誘導(dǎo)某些T細胞和白血病細胞發(fā)生PCD，將p53基因轉(zhuǎn)入白血病細胞中即可迅速引起PCD。bcl-2是抵抗PCD的基因，bcl-2基因的缺失突變將促進PCD的發(fā)生。目前，這些基因影響PCD的機制還不十分清楚。

二、免疫細胞中的凋謝

各種免疫細胞都存在有凋謝的現(xiàn)象，這對保持免疫系統(tǒng)的平衡十分重要。誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)PCD的因素有生理性和非生理性的。生理性因素如細胞因子濃度的改變、B細胞發(fā)育過程中Ig基因的重排等。非生理地因素如電離輻射、加熱、藥物等。體外培養(yǎng)的淋巴細胞對電離輻射尤為敏感，即使暴露在2-5Rad下也能產(chǎn)生形態(tài)改變，X身線和Y射線可誘導(dǎo)靜止期的淋巴細胞出現(xiàn)典型的凋謝改變，這一過程有賴于大分子的合成。加熱對于胸腺細胞來說是一種PCD凋謝特征的DNA降解。其它因素如甲醇、DMSO等在低濃度條件下可誘導(dǎo)PCD，濃度過高時則引起細胞的壞死。

（一)干細胞

干細胞在骨髓的造血環(huán)境中受到基質(zhì)細胞、細胞外基質(zhì)、生長因子和抑制因子的作用。這些因素共同作用，控制造血干細胞的自我更新和分化。細胞因子在造血干細胞的凋謝過程中發(fā)揮重要的作用，IL-3、GM-CSF、IL-6等不僅對于造血干細胞的增殖分化是必須的，而且對保持干細胞的存活也是必不可少的。去除這引起細胞因子將是致干細胞發(fā)生凋謝。因此，有的學(xué)者提出了一類新的造血因子概念，即造血挽救因子（survival factors)，這類因子的存在可以阻斷細胞凋謝的機制，通過其嘗試的變化影響凋謝，達到地造血干細胞調(diào)節(jié)的作用。EPO、IL-3、GM-CSF、G-CSF等對造血干細胞凋謝均有抑制作用。目前認為EPO對凋謝的抑制機理是，紅系干細胞發(fā)育從CFU-E或更早的BFU-E開始進入對EPO的依賴階段，在這一時期，如果失去EPO的維持，紅系干細胞將發(fā)生凋謝，EPO的作用只是抑制干細胞發(fā)生凋謝，但對細胞的DNA合成并漢骨促進作用。CFU-E中的紅系干細胞在無EPO存在的條件下培養(yǎng)16小時，70%的DNA被降解，在EPOSCF存在的條件下，DNA的降解比率分別為3%和42%。

（二)T細胞

1.胸腺細胞的發(fā)凋謝　淋巴干細胞通過血流進入胸腺，在胸腺中的發(fā)育成熟過程中要發(fā)生基因的重排和分化，同時，胸腺細胞要經(jīng)歷嚴格的選擇過程，只有那些對自身MHC分子親和力較高的細胞克隆才被允許發(fā)育為CD4+和CD8+雙陽性細胞（陽性選擇)。其中那些對自身抗原和力較高的胸腺細胞必須清除（陰性選擇)。胸腺細胞在胸腺中的陽性選擇和陰性選擇是通過凋謝機制來實現(xiàn)的，其機制與胸腺細胞和胸腺基質(zhì)細胞間的相互作用有關(guān)。大部分的胸腺細胞是未經(jīng)陽性選擇或陰性選擇過的，因此其平均壽命很短，只有3-4天，代表了胸腺中凋謝的整體水平。在胸腺細胞中，凋謝與內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素有關(guān)，未成熟胸腺細胞對糖皮質(zhì)激素是敏感的，而成熟T細胞對糖皮質(zhì)激素則是抵抗的。

2.活化T細胞與凋謝　靜止T細胞受到絲裂原CD3-TCR抗體的誘導(dǎo)而發(fā)生增殖，產(chǎn)生細胞因子。同樣的信號在未成熟T細胞和T細胞雜交瘤則誘導(dǎo)細胞的凋謝，這種凋謝也稱為活化誘導(dǎo)的細胞死亡（activation-inducedcell death, AICD)。決定這種差別的因素目前還不完全清楚，可能與Ca²⁺流量和蛋白激酶C（PKC)有關(guān)。蛋白激酶C可以阻斷引起核酸內(nèi)切酶海參性所需的Ca²⁺流，它可能通過抗原刺激依賴的第二因子（如IL-1激活的蛋白激酶C)的存在與否來誘導(dǎo)凋謝或增殖。

活化誘導(dǎo)的細胞死亡并不僅僅限于未成熟的胸腺細胞和T細胞雜交瘤，在成熟的外周T細胞也發(fā)現(xiàn)了類似的情況。表達TCRαβ或TCRγδ的小鼠和人T細胞在受到抗CD3-TCR抗體、PHA或抗Fas單抗的誘導(dǎo)時發(fā)生凋謝。

（1)活化狀態(tài)的外周T細胞更易發(fā)生凋謝：經(jīng)絲裂原活化和體外擴增培養(yǎng)的人外周T細胞對凋謝更為敏感。小鼠脾臟T細胞在對凋謝易感之前也需要受到抗原的激活。在活化的T細胞中，對凋謝的敏感性在CD4+和CD8+T細胞亞群之間無差異，在小鼠CD4+細胞中，Th1和Th2亞群之間亦無明顯的區(qū)別。

（2)細胞因子在凋謝中的作用www.med126.com：目前關(guān)于細胞因子在體外誘導(dǎo)和阻止凋謝中發(fā)揮作用的報道不盡一致。在輔助性T細胞亞群和細胞毒T細胞亞群中，不僅其激活和增殖需要依賴IL-2，其存活也需要IL-2的支持。如在上述細胞的培養(yǎng)基中支除IL-2可使細胞在6小時內(nèi)進入PCD。在體內(nèi)，這種對細胞因子的信賴性與機體在抗原清除后擴增的效應(yīng)淋巴細胞亞群的消失有關(guān)。以防止過高和維持時間過長的免疫應(yīng)答。

（3)抗原誘導(dǎo)的T細胞的凋謝：抗CD3單克隆抗體及PHA雖然能有效地誘導(dǎo)外周T細胞的活化，但它們不是生理性的刺激劑。目前認為AICD也能以抗原特異性的方式發(fā)生于T細胞，如超抗原葡萄球菌腸毒素（SF)能在體外及體內(nèi)誘導(dǎo)活化T細胞的凋謝�？乖�誘導(dǎo)的T細胞的凋謝也發(fā)生于同種異體抗原的刺激，當同時異體抗原再次刺激機體時，有20%-30%的同種異體反應(yīng)細胞發(fā)生了AICD。

（4)AICD的調(diào)節(jié)及其意義：相同的抗原在通過CD3-TCR刺激靜止T細胞活化的同時，也啟動了活化T細胞的凋謝過程。那么，靜止細胞和活化細胞發(fā)生凋謝是如何調(diào)節(jié)的呢？一種可能的機制是某一特定的T細胞克隆的活化和凋謝是同時進行的，抗原的量決定增殖抑或凋謝。SE超抗原在誘導(dǎo)部分活化細胞（40%-50%)凋謝的同時，也有MHCⅡ抗原陽性的抗原提呈細胞的作用下誘導(dǎo)其zxtf.net.cn余T細胞（50%-60%)的增殖。AICD是外周T細胞克隆清除（clonal deletion)的一種機制，有助于機體免疫耐受機制的建立，也是對細胞免疫調(diào)節(jié)的補充。當抗原活化的T細胞與特異性抗原接觸時誘導(dǎo)部分T細胞發(fā)生AICD，使得機體能在一定范圍內(nèi)限制免疫應(yīng)答的強度。

（三)B細胞

B細胞根據(jù)其分化的不同階段對抗原的刺激有不同的反應(yīng)。前B細胞在發(fā)育過程中必須經(jīng)歷免疫球蛋白的基因重排。基因重排未成功的B細胞將發(fā)生凋謝，重排成功的前B細胞最先表達膜表面IgM，如果前B細胞在這個階段接觸抗原，它們將會夭折，這是機體去除自身抗原反應(yīng)細胞的一種機制。因為大多數(shù)出現(xiàn)在骨髓的抗原是自身抗原。mIgM、mIgD陽性B細胞如無抗原刺激一般于24小時之內(nèi)在脾臟中死亡，脾臟B細胞胞核有高濃度的Ca²⁺、Mg²⁺，可誘導(dǎo)內(nèi)源性的核酸內(nèi)切酶，與無抗原刺激B細胞的凋謝有關(guān)。B細胞mIg結(jié)合相應(yīng)抗原的親和力成熟在保持B細胞的存活中起重要作用，只有對抗原刺激能產(chǎn)生高親和力抗體的B細胞才能逃避凋謝。

（四)髓樣細胞

免疫系統(tǒng)其它細胞中的嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和單核細胞都與炎癥發(fā)生密切相關(guān)。體外實驗表明，它們各自在炎癥中的作用可通過細胞因子對凋謝的發(fā)生來加以調(diào)節(jié)。髓樣細胞系HL-60細胞在培養(yǎng)時，除小部分細胞自發(fā)分化外，大部分細胞在經(jīng)歷5-7天的培養(yǎng)時間后發(fā)生凋謝。單核細胞在失去某些刺激時將發(fā)生PCD，F(xiàn)MLP、C5a、MCP-1、TGF-β、IL-2、IL-4和IL-6都不能阻止單核細胞的凋謝，而適當濃度的IL-1β、TNF-α、TIFN-γ和GM-CSF等炎癥因子則能阻斷單核細胞PCD過程�；罨�的單核細胞也通過自分泌方式產(chǎn)生IL-1β、TNF-α和GM-SCF。有趣的是，TNF-α在成熟單核細胞和單核細胞系U937中對PCD的誘導(dǎo)作用是完全相反的。新鮮分離的嗜酸性粒細胞在體外培養(yǎng)72-96小時后即進入PCD，而具有促進嗜酸性粒細胞集落形成作用的IL-5能使嗜酶性粒細胞的PCD過程推遲80小時。LPS、C5a和FMLP在體外能以劑量依賴式推遲中性粒細胞的PCD過程。炎癥因子對嗜酸性粒細胞和中性粒細胞PCD的推遲，有助于死亡的細胞被巨噬細胞完整地攝入并加以清除。

（金伯泉　孫凱)